烟草主要病害拮抗菌的筛选鉴定及除草活性分析

黄瑞环，芶剑渝，韩小斌，刘 京，彭玉龙，王 丹，张明岳，张成省，赵栋霖*

1. 中国农业科学院烟草研究所，山东省青岛市崂山区科苑经四路11 号 266101

2. 贵州省烟草公司遵义市公司，贵州省遵义市红花岗区延安路143 号 563000

3. 青岛农业大学，山东省青岛市城阳区长城路700 号 266109

烟草赤星病、黑胫病和青枯病是影响烟草产量和品质的重要病害。赤星病为典型流行病，具有间歇性和爆发性的特点［1］；黑胫病可危害烤烟、晾烟、晒烟、香料烟、白肋烟等栽培烟草［2］；而青枯病是典型的土传细菌性病害，在我国主产烟区普遍发生，造成巨大的经济损失［3］。同时，烟田杂草与烟株争肥、争水、争光，还是许多病虫害的媒介和寄主，诱发病虫害的发生和蔓延［4-5］。目前，烟草病害和烟田杂草的防治主要依赖化学药剂，导致农药残留、环境污染以及病原菌产生抗药性［6-7］等问题日益突出。生物防治对环境友好，被认为是替代化学药剂的理想途径。木霉属真菌是重要的生防菌，广泛应用于植物病害的防治中，对烟草病害的防治也有报道。有研究发现，哈茨木霉在培养皿上可吞没烟草黑胫病菌，对烟草黑胫病菌0号生理小种具有较强的抗性［8］；彭阁等［9］通过平板对峙法筛选出菌株里氏木霉ZP2-1 和拟康宁木霉ZP2-3，对烟草黑胫病菌具有较好的抑制效果；王革等［10］利用诱捕法从土壤中筛选出了1 株木霉菌株（Tv-1）对赤星病菌具有极强的拮抗作用。同时木霉在防除田间除草上也有报道，Javaid A 等［11］用4 种木霉的发酵液对小麦田的两种杂草进行了除草活性试验，发现4 种木霉的代谢物可显著降低两种目标杂草根和茎生长参数；朱海霞等［12］研究表明，菌株HZ-31 多孢木霉的可湿性粉剂对猪殃殃和藜两种阔叶杂草的盆栽除草效果显著高于纯发酵液。随着陆地微生物菌株筛选研究的深入，研究者们把寻找农药的目光投向了海洋。海洋木霉生长环境独特，代谢产物结构多样，且具有特殊的生物活性，是有待开发的新型生防微生物资源。目前海洋木霉在防治稻瘟病、棉花黄萎病、小麦赤霉病上已有研究［13-14］，但海洋来源木霉及其代谢产物用于防治烟草病害和烟田杂草上还鲜见报道。为此，以来源于海南红树林的海洋木霉为研究对象，以烟草黑胫病菌、赤星病菌、青枯病菌及烟田杂草反枝苋（Amaranthus retroflexus）为靶标进行了生防菌株的筛选，旨在为进一步开发海洋微生物用于烟草有害生物的防治奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品来源

海洋木霉分离自海南红树（根、茎、叶）和红树林海泥。

1.1.2 病原菌

供试病原菌为烟草黑胫病菌（Phytophthora parasitica var. nicotianae）、烟草赤星病菌［Alternaria alternate（Fries）Keissler］、烟草青枯病菌（Ralstonia solanacearum），均由中国农业科学院烟草研究所植物保护研究中心提供。

1.1.3 培养基

（1）海洋真菌分离纯化培养基：3%海盐马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基；（2）病原菌培养基：黑胫病菌用燕麦（OA）培养基培养，赤星病菌用PDA 培养基培养，青枯病菌采用营养肉汤（NA）培养基。海洋真菌和病原菌于-80 °C 保藏于中国农业科学院烟草研究所海洋农业研究中心。

1.2 试验方法

1.2.1 海洋木霉的分离

红树（根、茎、叶）样品采用平板稀释法［15］和组织分离法［16］进行海洋真菌的分离，海泥样品采用平板稀释法进行海洋真菌的分离。海洋木霉用3%海盐PDA 培养基分离，放入28 ℃培养箱中，倒置培养3～7 d，根据菌落颜色、菌丝长短等形态特征挑取木霉菌丝于PDA 培养基中培养，重复2～3次进行纯化，并归类、编号，于-80 ℃超低温保存。

1.2.2 海洋木霉的鉴定

海洋木霉的DNA 提取方法参考文献［17］。PCR 扩增采用真菌通用引物ITS1 和ITS4［18］，获得的PCR 扩增产物使用1%的琼脂糖凝胶电泳，确定扩增产物的大小。PCR 扩增产物由青岛擎科梓熙生物技术有限公司进行测序，获得的序列通过Blast 程序在GenBank 上进行比对，选取同源性较高ITS 基因序列进行同源性比较，并采用MEGA7.0 中的Neighbour-joining 法构建系统发育树，鉴定海洋真菌的种属。

1.2.3 活性海洋木霉的筛选

将分离的海洋木霉和3 种烟草病原菌（烟草黑胫病菌、赤星病菌和青枯病菌）采用平板对峙培养法［19］进行活性筛选，设置空白对照。每处理3 次重复，置于28 ℃恒温培养箱中培养，7 d 后观察抑制效果。海洋木霉对青枯病菌采用十字交叉法测量其抑菌圈直径，对黑胫病菌和赤星病菌计算抑制率。计算公式：

抑菌率=［（病原菌对照菌落半径-病原菌指向海洋真菌的半径）/病原菌对照菌落半径］×100%

（1）

1.2.4 除草活性

将反枝苋种植于边长10 cm 的正方形塑料盒中，每盒20 粒，在人工气候箱中（28 °C，12 h 光照，12 h 黑暗）培养1 周。海洋真菌采用PDW 培养基振荡培养9 d 后，其发酵液用乙酸乙酯萃取两次，用旋转蒸发仪在40 ℃和90 r/min 的条件下浓缩蒸干。海洋真菌发酵提取物用4%甲醇-无菌水溶解，并加入0.2%农乳1602（三苯乙烯基苯酚聚氧丙烯聚氧乙烯醚）助溶，配制成10.0 mg/mL 的溶液，喷雾于叶片和茎上，每盆喷雾量3 mL。以等量无菌水溶液和草甘膦为对照，置于28 ℃人工气候箱中，12 h 光照，12 h 黑暗，7 d 后观察除草效果。

1.3 数据处理

采用Excel 2019 和MEGA7.0 软件进行数据处理、分析和作图。用SPSS Statistics 19 软件、Duncan’s 新复极差法检验数据差异显著性。

2 结果与分析

2.1 海洋木霉分离鉴定及多样性分析

从海南红树根、茎、叶和海泥样品中共分离得到25 株海洋木霉。其中从红树根中分离得到11株，占总数的44%；海泥中分离得到10 株，占总数的40%；茎中得到4 株，占总数的16%；红树的叶中没有分离得到木霉，见图1。

通过分子生物学鉴定，将PCR 产物进行测序，并将所测序列在美国生物信息中心（NCBI）数据库中用Blast 进行相似性搜索，发现所得木霉和与其序列最为接近的木霉相似度均在99%～100%之间，由此确定菌株种属范畴。将测序后获得的ITS序列提交到GenBank 数据库中，获取其登录号。

图1 不同样品分离的木霉数量比较Fig.1 Amounts of Trichoderma sp. isolated from different samples

根据这25 株木霉的ITS-rDNA 序列及Blast 比对结果，利用MEGA 7.0 软件，分析碱基组成并用邻接法构建系统进化树，见图2。从图2 可以看出，25 株海洋木霉属于5 个种。HJ5、HJ7 等17 株木霉为棘孢木霉（Trichoderma asperellum），HT8 和HT10 为钩状木霉（Trichoderma hamatum），HT11 为拟康宁木霉（Trichoderma koningiopsis），HT6、HT7为 里 氏 木 霉（Trichoderma reesei），HT4、HT12 和1HT 为哈茨木霉（Trichoderma harzianum）。25 株海洋木霉中，棘孢木霉占68%，哈茨木霉占12%，钩状木霉和里氏木霉分别占8%，拟康宁木霉占4%。

2.2 海洋木霉对烟草病害的拮抗效果

通过平板对峙培养，测定了25 株木霉对烟草黑胫病菌、赤星病菌和青枯病菌的抑制作用，对黑胫病菌和赤星病菌的抑制率分别达60%和40%。多数海洋木霉对烟草黑胫病菌和赤星病菌具有明显的拮抗作用（表1），只有HT6 和HT7 两株木霉对青枯病菌有抑制作用（图3）。从表1 中可以看出，23 株海洋木霉对烟草黑胫病菌的抑制率达到30%以上，HT2、HT6、HT8、HT11、HJ3、5HJ、HJ7、HG2、HG9、9HG、HG11、HG14 和HG16 共13 株海洋木霉的抑制率达到60%以上，其中以5HJ 的抑制效果最好，抑制率为84.1%。HT11、HG11、HT3、HG16 和HG9 等5 株木霉对烟草赤星病菌的抑制效果较好，分别达到40.3%、42.9%、43.7%、44.5%和47.9%。5HJ、G9、HG16 和HT11 等对烟草黑胫病菌和赤星病菌均具有较好的抑菌效果。

2.3 海洋木霉对反枝苋的抑制效果

从图4 和表2 中可以看出，多数海洋木霉提取物对杂草反枝苋的除草效果不明显，仅有HT10 和1HT 两株木霉的提取物对反枝苋的生长有抑制作用。HT10 的除草活性较高，经其发酵提取物处理后的反枝苋叶片出现枯萎、生长不正常、叶片发黄；1HT 处理的反枝苋部分叶片呈现红色斑点，部分嫩叶出现枯萎，叶片发黄。由于HT10 除草效果更为明显，因此可考虑从HT10 发酵提取物中寻找具有除草活性的先导化合物。

图2 海洋木霉与参考分类群间的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree between marine-derived Trichoderma sp. and reference taxa

表1 木霉对烟草黑胫病菌和赤星病菌的抑制率①Tab.1 Inhibition rates of Trichoderma sp. against Phytophtora parasitica var. nicotianae Tucker and Alternaria alternata（Fries）Keissler （%）

图3 5HJ、HG9、HT6 和HT7 平板对峙抑菌效果Fig.3 Antibacterial effects of 5HJ, HG9, HT6 and HT7 plates

图4 HT10 和1HT 对反枝苋的除草效果Fig.4 Herbicidal effects of HT10 and 1HT against A. retroflexus L.

表2 木霉对反枝苋的抑制效果①Tab.2 Inhibition effects of Trichoderma sp. against Amaranthus retroflexus L.

3 结论

从海南红树和海泥中分离得到25 株海洋真菌，鉴定为5 种木霉。其中棘孢木霉（T. asperellum）为优势种。海洋木霉及其提取物对烟草黑胫病菌（P. parasitica var. nicotianae）、赤星病菌［A. alternate（Fries）Keissler］和青枯病菌（R. solanacearum）3种病原菌均有抑制效果。其中，3 株棘孢木霉5HJ、HG9、HG16 和1 株拟康宁木霉HT1 对烟草黑胫病菌和赤星病菌有较好的抑制效果；1 株钩状木霉HT10 和1 株哈茨木霉1HT 具有潜在除草活性。可见，海洋木霉多个属种表现出了抗菌除草活性，具有开发成为新型生物农药的潜力。