超滤膜组合技术对烟草提取物化学成分的影响

郑建宇，刘 晶，周桂园，，殷沛沛，董高峰，王保兴，吴建霖，李美红，周 潇，尚可超

1. 中烟施伟策（云南）再造烟叶有限公司， 云南省玉溪市红塔区大营街蔡官屯89 号 653100

2. 云南中烟工业有限责任公司技术中心， 昆明市五华区龙泉路548 号 650202

烟草提取物通常经加热提取和减压浓缩制备得到。烟草提取物中对抽吸品质有负面影响的物质如蛋白质、多糖等分子量较大的成分未被除去，而对感官特征有重要作用的小分子和易挥发成分未经过富集，其质量和功能特征的稳定性主要取决于烟草原料［1-6］，由于烟草原料的波动对料液特征的影响较大，因此有必要采用适当的分离纯化技术对烟草提取物进行处理。膜分离技术具有分离和浓缩同步进行的特点［7］，采用该技术在室温下处理烟草提取物时，可最大限度地富集热敏性的致香物质和易挥发成分［8-10］，减少这些成分的加工损失。通过超滤膜组合分离技术，可对提取物中各类组分定向分离与截流，富集对感官特征有功能性作用的有效部分，去除对口感有负面影响以及烟气中焦油和CO 前体物的成分［11］，从而实现各类组分的重组和相关产品香韵的调节，提高其各类化学成分的可调控性和在卷烟配方中的适用性。近年来，多级膜组合技术应用广泛，比如天然产物的分离纯化及富集［12-16］，饮用水和工业用水的净化与循环利用［17-19］，饮料及酒制品的浓缩和净化［10，20］，制药工业中活性成分的制备及细菌和热原的去除［21-24］。目前，多级膜组合技术在烟草提取物的分离、除杂、浓缩及感官评价方面的应用研究较少［4-5］。因此，设计5 级超滤膜组合，将烟草提取物按分子量大小进行分组，考察各级膜截留液的主要化学成分及含量的变化，旨在筛选烟叶提取物中的有效部分，提高烟草提取物在再造烟叶上的应用效果。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

2016 年昆明石林生产的K326 品种C3F 等级的烟叶，由云南中烟工业有限责任公司技术中心提供。

二氯甲烷、无水硫酸钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；乙酸苯乙酯标准品（≥98%，美国Sigma 公司）。

R-220SE 旋转 蒸发 仪（瑞 士Büchi 公 司）；Milli-Q Element 型超纯水仪（美国Millipore 公司）；GCM-S-02 卷式膜过滤系统（国初科技厦门有限公司）；10 kDa、2 kDa、1 kDa、700 Da、300 Da 的聚醚砜 膜 元 件（ 德 国 Microdyn-Nadir 公 司）；BSA224S-CW 电子天平（感量0.000 1 g）、G-26C 高速离心机（德国Sartorius 公司）；7890B/5977A 气质联用仪（美国Agilent 公司）；FUTURA-II Alliance 连续流动分析仪（法国Alliance 公司）。

1.2 方法

1.2.1 超滤样品的制备

准确称取1 000 g 烟叶，加入7 L 水加热提取，60 ℃下提取2 次；合并烟草提取液，用滤纸减压过滤，取200 mL 滤液留样，供检测和评价使用。将其余提取物加入过滤系统的进样端，依次经过10 kDa、2 kDa、1 kDa、700 Da 和300 Da 五级膜分离。根据膜材的耐压性和通量上限及样品的实际通量，适当调控进出口压力差（≤0.6 MPa），五级膜实际通量分别为86.5、22.0、19.0、10.0、3.0 L/h·m2，工作温度低于30 ℃。当截留液体积明显减少，滤液流速明显降低时，加入适量纯化水继续过滤，重复3 次后更换膜件进行下一级过滤。分别收集截留液和滤液待用。

1.2.2 常规化学成分的检测

使用连续流动分析仪，分别按照YC/T 159—2002、YC/T 160—2002 和YC/T 161—2002 对各级膜截留液的总糖、还原糖、总植物碱和总氮进行含量测定［25-27］，检测结果通过各级膜截留液的得率换算为100 g 烟叶中4 类化学成分的质量，评价各级膜对总糖、还原糖、总植物碱和总氮的富集效果。

1.2.3 挥发性香味成分的检测

前处理：分别称取1.2.1 节中制备的相当于1 g固含物的截留液，浓度较高时加水稀释至相近体积，再加入等体积的二氯甲烷分别萃取3 次；合并萃取液，加入无水硫酸钠干燥过夜；转入烧瓶中，并加入内标物（乙酸苯乙酯）50 μg，于40 ℃下常压浓缩至1 mL，待测。GC-MS 分析条件为：

色谱柱：HP-5MS 毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；进样口温度：250 ℃；程序升温：初始温度50 ℃，保持2 min，以3 ℃/min 升至260 ℃，保持1 min，再以16 ℃/min升至300 ℃，保持4 min；载气：高纯氦气，流速1.0 mL/min；进样方式：分流进样，分流比10∶1；进样体积：1 μL。离子源：EI；电离能：70 eV；离子源温度：180 ℃；传输线温度：260 ℃；检测模式：全离子扫描监测；质量扫描范围：30～750 amu；溶剂延迟：2 min；根据NIST11 谱库检索，以匹配度≥80%进行定性。

GC-MS 半定量方法：根据某化合物与内标物的峰面积比与浓度比成正比，计算该化合物的含量。假设内标物的相对校正因子为1，按公式Wi=Ai/As·Ws计算。其中，Wi为组分i 的质量，Ai为组分i峰面积，As为内标物峰面积，Ws为内标物质量。最终组分含量单位换算为μg/g，各化合物含量再对应到各级膜截留液的总量和得率，换算为100 g 烟叶中各化合物的质量。

1.2.4 再造烟叶样品的制备和感官评价

根据各级膜截留液和原提取物的固含量，以等量方式加入涂布配方中制样，在恒温恒湿条件下平衡24 h，切丝卷制后进行感官评吸。

2 结果与讨论

2.1 各级膜截留液的固含量和得率

将1.2.1 节中制备的样品准确称量，得到各级膜截留液总量，采用烘箱法［28］测试固含量，计算公式：得率=样品总量×固含量/原烟叶质量，结果见表1。可以看出，将原提取物进行超滤膜组合分级过滤后，10 kDa、300 Da 膜截留液和300 Da 膜滤液的得率较高，2 和1 kDa 膜截留液的得率偏低。截留液和滤液的固含物累加值仅为原液固含物质量的86%，可能是由于在各级膜分离过程中，特别是更换下一级膜时有一定量的物质损失，因此后续实验中将2 和1 kDa 膜截留液合并，即样品经过10 kDa 过滤后，不再进行2 kDa 过滤，依次通过1 kDa、700 Da 和300 Da 膜 继 续 过 滤，从 而 提 高得率。

表1 各级膜截留液的固含量和得率Tab.1 Solid content and yield of retentate of each membrane

2.2 常规化学成分的变化

采用连续流动分析法对1.2.1 节中制备的样品进行测试，根据各级膜截留液的总量和固含量，以100 g 原烟叶计，换算得到总糖、还原糖、总氮和总植物碱随着超滤膜孔径变化的富集量，结果见表2和图1。

由表2 和图1 可以看出，各级膜截留液和滤液的糖含量累加值仅为原液中糖含量的50%左右，若按2.1 节的得率计，应该为80%左右。烟草提取物原液是固含量为2.73%的低浓度样品，而各级膜截留液的测试样品是浓缩后固含量较高的样品，部分分子量较大的糖类物质溶解性降低，在进行样品前处理时形成部分沉淀，例如，10 kDa 膜截留液的沉淀就比较多，这些沉淀可能包含部分糖类物质。为了符合仪器测试需求，需将这些沉淀滤去，从而导致各级膜截留液的糖类物质实测值累加后低于原液中的糖含量。

10 kDa 膜截留液的总糖含量最高，还原糖含量较低，10 kDa 膜截留液中非还原糖含量为2.88 g/100 g，而其他各级膜截留液和滤液中的非还原糖总量为0.85 g/100 g。由于大部分多糖无还原性，因此认为10 kDa 膜截留了烟叶提取物中的大部分多糖，截留总量约为4.03 g/100 g 烟叶。

从2 kDa～300 Da，随着超滤膜孔径的降低，还原糖含量呈逐渐上升趋势。还原糖在300 Da 膜的截留液和滤液中含量较高，分别为2.32 和3.31 g/100 g 烟叶。

总植物碱主要富集在300 Da 膜截留液中，其含量超过了其他各级膜截留液的总和。300 Da 膜滤液中的总植物碱富集量约为其他各级膜截留液烟碱量的55%。两部分的烟碱量之和占原烟叶总植物碱含量的70%以上。

表2 各级膜截留液的化学成分①Tab.2 Chemical components in retentate of each membrane （g）

对比总氮和总植物碱可知，10 kDa 膜截留液的总氮远高于总植物碱，因此认为10 kDa 膜截留液的总氮主要为除生物碱之外的以蛋白质为主的有机氮成分，这也说明10 kDa 膜具有截留烟叶提取物中蛋白质类成分的重要作用。

图1 各级膜截留液的化学成分比较Fig.1 Comparison of chemical components in retentate of each membrane

2.3 挥发性成分的变化

按1.2.3 节的前处理和检测方法对1.2.1 节中制备的样品进行分析测试，共鉴定出71 个成分，其中醇类11 个，酮类19 个，醛类1 个，酯类10 个，酚类3 个，酸类4 个，杂环类17 个，烃类6 个；采用AMDIS 方式进行积分，通过半定量法计算后结合各级膜截留液的固含量和得率，将各成分换算为100 g 烟叶中的质量，结果见表3。

由表3 可以看出，与其他截留液相比，300 Da膜滤液中的特有成分较多，包括：乙酸-1-羟基-2-丙酯、泛酰内酯、N-甲基吡咯烷酮、甲基吡咯烷酮、N-甲基丁二酰胺、麦芽酚、琥珀酰亚胺、2-己烯-4-醇、戊二酰亚胺、2-氮己环酮、γ-羟甲基-γ-丁内酯、苯甲酸、乙琥胺、苯乙酸、吲哚、2,6-二甲基-2,7-辛二烯-1,6-二醇、对羟基苯乙醇、N-甲基烟酰胺、香草乙酮、2,3'-联吡啶、高香草醇、2,4-二羟基苯甲醛、乙酰丁香酮、3-吲哚乙醇、6,7-二甲氧基香豆素、新植二烯和正二十六烷。

300 Da 膜截留液的特有成分包括：乙酸丁酯、1-辛烯-3-酮、苯甲醇、1,3,7,7-四甲基-2-氧杂双环［4.4.0］-5-葵烯-9-酮、八氢-2,5,5,8a-四甲基-7H-1-苯并吡喃-7-酮、4-羟基-β-二氢大马酮、6-甲基烟酸。

700 Da 膜截留液的特有成分包括：甲酸异丁酯、苯乙醇、α-亚甲基-γ-戊内酯、茄酮、二烯烟碱、巨豆三烯酮、松柏醇。

1 kDa 膜截留液的特有成分包括：丙酸、乙酸丙酯、吡啶、丙酸丙酯和乙酸正十七烷基酯。

2 kDa 膜截留液的特有成分为乙酸仲丁酯。

10 kDa 膜截留液的特有成分为N,N-二甲基乙酰胺。

表3 各级膜截留液的挥发性成分及含量Tab.3 Volatile components and their contents in retentate of each membrane （μg·100 g-1）

表3 （续）

表3 （续）

部分组分存在于各级膜截留液中，如保留时间在2～6 min 的小分子化合物，原液中没有检出。原因是不同孔径的超滤膜对各类成分有富集作用，即使原液中上述成分的含量低于检出限，而富集后可被检出。

有些组分在原液中含量较高、但截留液和滤液中检出值较低。这是由于这些组分的水溶性稍差，分离过程中在膜件上形成了死吸附［29-32］，因此原液中这些组分的含量远高于各级膜截留液中的含量。

10、2 和1 kDa 膜截留液的挥发性香味成分的种类和含量均较低，对产品香气特征的贡献较小；烟叶中的特征性成分茄酮、巨豆三烯酮和二烯烟碱主要富集在700 Da 膜截留液中；烟碱及其衍生物去氢新烟碱、可替宁和6-甲基烟酸主要富集在300 Da 膜截留液中；300 Da 膜滤液富集的小分子化合物最多，若不计烟碱，以原烟叶提取物计，该部分的挥发性成分总量最高，达到207.81 μg/g。

2.4 各级膜截留液对再造烟叶感官质量的影响

参考杜锐等［4］的评价方法，由5 名具有专业资质的感官评吸人员对1.2.4 节中制备的样品进行对比评吸，结果见表4。可以看出，10、2 和1 kDa 膜截留液加入配方后，香气质和香气量等指标均较对照（原提取液）差，具体表现为焦煳味重，刺激性大，香气不清晰；而700 Da、300 Da 膜截留液和300 Da 膜滤液对上述感官指标有明显的改善作用，具体表现为烟气的清甜感和绵柔感增加，香气更丰富，杂气和刺激性明显降低。原烟叶（K326）的头香和体香特征较明显。

表4 各级膜截留液的感官评价结果①Tab.4 Sensory evaluation result of retentate of each membrane

3 结论

采用超滤膜组合工艺进行烟叶提取物处理时，10 kDa、300 Da 膜截留液和300 Da 膜滤液的得率较高，2 和1 kDa 膜截留液的得率较低，300 Da超滤膜有利于还原糖和总植物碱的富集，10 kDa超滤膜有利于多糖和蛋白质类成分的富集。通过10 kDa 和300 Da 两级膜组合可以实现烟叶提取物中多糖、蛋白质和还原糖及总植物碱的调控。

10、2 和1 kDa 膜截留液的挥发性香味成分的种类和含量都较低，对产品香气特征的贡献较小。烟叶的特征性成分在700 和300 Da 两级膜上的富集各有特色，多数烟叶中常见的小分子醇、酮、酯和杂环类成分都富集在300 Da 膜的滤液中，其对产品的香气特征有重要作用。通过适当的超滤膜组合可以富集和制备目标组分，从而可实现各类成分的调控。

10、2 和1 kDa 膜截留液对再造烟叶感官品质有明显的负面影响，而700 Da、300 Da 膜截留液和300 Da 膜滤液对感官特征有明显的改善作用，具体表现为香气较丰富，原烟叶的头香和体香特点突出。本研究结果可为应用膜分离技术开发各种烟用香料和对其各类化学成分进行调控提供参考。