基于15N 同位素示踪技术的烤烟品种上部叶氮积累和氨挥发量差异分析

徐清泉，刘化冰，尚晓颍，程昌合，张晓兵，夏 琛*，张勇刚，金慧清，徐世晓，杨铁钊，邹光进

1. 浙江中烟工业有限责任公司，杭州市上城区中山南路77 号 310024

2. 河南农业大学烟草学院，郑州市文化路95 号 450002

3. 贵州省烟草公司黔东南分公司，贵州省凯里市清江路33 号 556000

氮素在烤烟生长发育过程中起着重要作用，对烟叶产量和品质有重要影响［1-3］。烤烟的氮元素主要来源于土壤中的氮（土壤氮）和肥料中的氮（肥料氮），在一定生态和品种条件下，施肥是调控烟叶产量和品质的重要手段［4-5］。时向东等［6］研究表明，随着烤烟生育期的推进，烟叶中氮积累量在旺长期增幅最大，烟株对土壤氮的吸收积累量显著高于肥料氮，同时肥料氮占总氮含量的比例不断降低；杨志晓等［7］研究提出，烤烟在生育前期以吸收肥料氮为主，在成熟期后以吸收土壤氮为主，烟株整个生育期吸收的氮素主要来源于土壤氮，且吸收的土壤氮及占总氮含量的比例随生育期的推进和叶片着生部位的升高而增加。氨气挥发是植物氮素再转移的主要形式之一，烟叶在衰老过程中氮素营养物质降解导致了叶片NH4+积累并通过质外体以氨气的形式挥发到大气中［8-9］。Mattsson 等［10］发现两种不同基因型烟草的氨气挥发量相差1 倍以上，原因是品种间质外体NH4+浓度和pH 存在差异；武云杰等［11］研究提出，不同烤烟品种烟叶氨气挥发量随叶龄增加而呈现先上升后下降的趋势，氮素利用效率低的品种氮素转移量和氨气挥发量大。近年来随着卷烟大品牌的发展，优质烟叶资源供求矛盾日益凸显，等级结构不合理，烟叶使用效率低的问题一直存在［12］。上部叶占整株烟叶的三分之一，占总产量的35%左右。目前我国上部烟叶存在的主要问题是碳氮代谢不够协调，烟叶成熟不充分，导致叶片结构紧实，内在化学成分协调性不佳，刺激性大，劲头足［13-14］。贵州黔东南地区属中亚热带季风湿润气候，植烟地多位于海拔800 m 左右的山地，昼夜温差大，降雨量分布不均匀，烤烟生长期间存在前期供氮不足，后期供氮过剩的问题，严重影响优质烤烟的生产，尤其是上部叶的成熟度［15］。为此，利用15N 同位素肥料作为全部供氮肥料，进行了黔东南烟区烤烟上部叶氮含量、氮素积累量、土壤氮和同位素肥料氮积累比例，以及上部叶的氨挥发量试验，并分析了黔东南烟区上部叶的氮素状况和氨挥发量在品种间的差异，旨在为合理调控烟草施肥水平，提高上部叶的可用性提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验于2017 年在黔东南苗族侗族自治州“利群”舞阳基地单元进行，供试烤烟品种为云烟87和K326。土壤类型为黄壤，土壤基础养分状况：全氮1.11 g/kg，碱解氮50.9 mg/kg，有效磷8.7 mg/kg，缓效钾179.2 mg/kg，速效钾53.6 mg/kg，有机质16.01 g/kg，pH 6.43。

1.2 试验设计

以当地推荐的最佳氮用量97.5 kg/hm2为准，试验区施用同位素标记的氮肥为15（基肥，占70%）和K15NO3（追肥，占30%），两种肥料15N 丰度分别为10.21%和10.28%，由上海化工研究院 提 供。磷 肥 为Ca（H2PO4）2，钾 肥 为K2SO4和KNO3，磷 肥、钾 肥 用 量 分 别 为633.10 kg/hm2、471.11 kg/hm2，于烟苗移栽前穴施。作基肥的氮肥于移栽前穴施，移栽后30 d 追施30%的氮肥。烟苗于4 月10 日移栽，行株距120 cm×55 cm，四周设置保护行，在施有同位素氮肥的垄上植烟40 株，采用随机区组，两品种均设置3 个试验处理小区，每小区为1 次重复，共计6 个小区。按照当地优质烟叶生产技术规范进行田间管理，每小区按照5点取样法取土壤样品。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 烟样的采集

于移栽后7、9、11、13 和15 周分别取3 株烟，上部叶为15～18 叶位（从下到上）。采集烟样后一部分样品于105 ℃杀青30 min，并在70 ℃烘干至恒质量。粉碎，过0.25 mm 网筛，用于全氮含量和15N 丰度的测定，并计算烤烟的氮素吸收积累量。每份样品均平行检测3 次。

1.3.2 氮含量的测定

采用凯氏定氮法测定烟株全氮含量［16］；采用质谱法测定同位素15N 标记的原子百分超［17］。

1.3.3 氨气挥发量的测定

图1 氨气收集装置Fig.1 Ammonia gas collection device

烤烟叶片氨气挥发量的测定装置如图1所示［18］。采用密闭室间歇通气法收集氨气［19］，先用聚乙烯塑料薄膜袋（透光率90%）套住待测定的叶片，薄膜袋口部密封；再通过微型充气泵将空气通入含有0.5 mol/L H2SO4的三角瓶中，除去空气中的NH3；让气体通过叶片后，再通过0.005 mol/L 的H2SO4溶液的串联装置收集。打开电源，在气密性良好的情况下收集24 h，汇集收集液。采用质谱法测定氨气收集液中15N 标记的原子百分超［17］。

1.4 计算方法

参照时向东等［6］的方法计算烟株吸收的氮素来源于肥料和土壤的量，参照武云杰等［11］的方法计算烟叶氨挥发来源于肥料和土壤的量。计算公式为：

烟株吸收的肥料氮占总吸收氮量的百分比（Ndff%）=［（烤烟中15N 原子百分超-0.365%）/（肥料的15N 原子百分超-0.365%）］×100% （1）

式中：0.365%是自然界中15N 含量；Ndff 表示来自肥料的氮素，简称肥料氮。Ndff=Ndff%×烟株各部位累计的总氮量 （2）Ndfs=作物吸氮量-Ndff （3）式中：Ndfs 表示来自土壤本身的氮素，简称土壤氮。

烤烟烟叶的氨挥发量：

NH3-N［μg·m-2·h-1］=［M/（A×D）］×10-2（4）

式中：M 为每次测得的氨量（NH3-N，μg）；A为装置的横截面积（m2）；D 为每次连续吸氨时间（h）。

肥料氮氨挥发量=（氨气收集液中15N 原子百分超/烟叶中15N 原子百分超）×100%×氨总挥发量

（5）

土壤氮氨挥发量=氨总挥发量-肥料氮氨挥发量（6）

1.5 数据处理

采用Excel 2010 初步处理数据并绘制图表，用SPSS 20.0 软件进行单因素方差分析，用Duncan’s新复极差法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 不同生育期烤烟上部叶氮含量和氮素积累量的变化

由图2 可以看出，两个品种烤烟上部叶的氮含量随着生育期的推进，总体呈现下降趋势，在移栽后77 d 下降比较明显，云烟87 和K326 上部叶下降比例分别达到45.28%和43.86%。在整个生育期中云烟87 上部叶的氮含量总体小于K326 的上部叶的氮含量，差异达到极显著水平。在生育后期77、91 和105 d 时间段内，两个品种上部叶的氮含量基本稳定，下降幅度不明显。说明在同等条件下，不同品种的上部叶氮含量间存在极显著差异，但品种间氮含量变化规律差异不明显。

图2 不同生育期两品种烤烟上部叶氮含量变化Fig.2 Changes of nitrogen content in upper leaves of two flue-cured tobacco varieties at different growth stages

图3 不同生育期两品种烤烟上部叶氮积累量变化Fig.3 Changes of nitrogen accumulation in upper leaves of two flue-cured tobacco varieties at different growth stages

由图3 可以看出，两个品种烤烟上部叶的氮积累规律相似，随生育期的推进呈先升高后降低的趋势，在移栽后63 d 两品种的氮积累量达到峰值，云烟87 和K326 的上部叶氮积累量分别为1.36 g/株和1.49 g/株，两品种在移栽后63 d 的氮素含量较高，但较移栽后49 d 没有明显变化。说明在移栽后63 d 对上部叶来说是氮素吸收分配的关键节点，移栽后63 d 烟株处于旺长期，此时上部叶氮积累量也达到峰值；移栽后91 d 烤烟两品种的上部叶氮积累量与移栽后77 d 相比差异较小，可能是由于实施烟株打顶抹杈等大田农艺管理措施，人为改变了氮积累的库源，而对上部叶氮素积累产生一定影响，导致烟株对氮素重新进行分配。不同品种间上部叶的氮积累规律相似，但在积累量上的差异达极显著水平，说明K326 上部叶的氮积累能力大于云烟87。

2.2 不同生育期烤烟上部叶中来源于土壤和肥料的氮素积累量的变化

图4 不同生育期两品种烤烟上部叶来源于土壤和肥料的氮积累量变化Fig.4 Changes of nitrogen accumulation in upper leaves of two flue-cured tobacco varieties from soil and fertilizer at different growth stages

从烤烟两品种上部叶对两种氮源吸收的情况（图4）来看，氮积累来源于土壤和肥料氮中的量变化规律与总氮积累规律一致，即随生育期的推进均呈现先升高后降低的趋势，同时在移栽后63 d是两品种上部叶氮积累的关键节点，且氮积累量达到峰值。移栽后63 d 之前，两烤烟品种上部叶的氮源主要来自肥料氮，在移栽后63 d 之后土壤氮作为主要氮源供给两品种上部叶的生长发育。说明试验点土壤在烤烟上部叶生长发育后期有较强的供氮能力，且烟株上部叶的氮积累量主要来自土壤氮。

2.3 不同生育期烤烟上部叶氨挥发量的变化

从图5可以看出，两个品种烤烟上部叶氨挥发基本呈现出先升高后降低的趋势，但两个品种氨挥发量峰值出现的时间段存在差异，K326品种的峰值出现在移栽后91 d，达到10.96 μg·m-2·h-1，云烟87氨挥发峰值出现在移栽后77 d，达到19.98 μg·m-2·h-1。在移栽后91 d 之前，两个品种上部叶氨挥发量间差异极显著，在移栽后105 d 时，两个品种的氨挥发量趋于平稳，差异不明显。说明在相同的生态环境条件下，不同品种上部叶在生育期中的氨挥发量存在差异。

图5 不同生育期两品种烤烟上部叶的氨挥发量变化Fig.5 Changes of ammonia volatilization in upper leaves of two flue-cured tobacco varieties at different growth stages

2.4 不同生育期烤烟上部叶氨挥发中氮源的变化

从图6 可以看出，两个品种上部叶氨挥发中氮源的变化趋势一致，移栽后77 d 为1 个时间节点，移栽后77 d 之前氨挥发中的氮主要来源于土壤氮，移栽后77 d 之后则主要来源于肥料氮。不同品种氨挥发氮源间差异极显著，且氮源的比例在不同品种间存在显著差异。说明上部叶氨挥发中的氮源主要来源于肥料氮，烟株生长发育后期氨挥发量大于生长发育前期。

图6 不同生育期烤烟两品种上部叶来源于土壤氮和肥料氮中氨挥发量的变化Fig.6 Changes of ammonia volatilization in upper leaves of the two flue-cured tobacco varieties from soil and fertilizer nitrogen at different growth stages

3 讨论

有研究表明［20-23］，烤烟前期的生长发育以吸收肥料氮为主，之后土壤氮的比例逐步提高，而且随着烟株生育期的推进和叶片着生部位的升高，土壤氮的比例显著增加。本试验中，移栽后63 d之前，两烤烟品种上部叶的氮主要来源于肥料氮，在移栽后63 d 之后土壤氮作为主要氮源供烤烟上部叶的生长发育，与前人的研究结果一致。说明黔东南烟区土壤中残留的全氮和速效氮对烤烟上部叶氮素营养有重要影响，对土壤中残留氮素的有效控制是生产优质烤烟上部叶的重要条件。本试验结果显示，不同品种上部叶氮含量和氮素积累量的变化趋势基本一致，氮素含量随着生育期的推进，总体呈下降趋势；氮素积累量呈先升高后降低的趋势，在移栽后63 d，上部叶氮积累量达到峰值，与邓云龙等［24］的研究结果基本一致。但不同品种上部叶的氮素含量和积累量间差异达极显著水平，说明不同品种对氮素营养的响应存在基因型上的差异，在黔东南目前的条件下云烟87 品种上部叶在氮素积累、利用及对氮素营养响应上低于K326。

陈刚等［25］研究表明，叶片进入生长发育后期，蛋白水解酶活性显著增强，产生大量的NH3。正常情况下，多余的NH3由于谷氨酰胺合成酶的作用会被重新利用，生育后期因为谷氨酰胺合成酶活性减弱，多余NH3难以被再次转化利用，经质外体由叶片挥发到大气中。刘化冰等［26］研究认为，不同烤烟品种在田间的耐肥性差异，也与生育后期经过叶片挥发的氨气量有关，田间表现耐肥性高、容易成熟落黄的品种，在生育后期的氨气挥发总量大于不耐肥的烤烟品种。本试验结果表明，黔东南两个主栽品种上部叶氨挥发量的变化规律一致，均呈现出先升高后降低的变化趋势，但两个品种氨挥发量峰值出现的时间段和氨挥发总量存在差异。与K326 品种相比，云烟87 品种氨挥发量峰值出现的时间段提前，且氨挥发总量较大，表明云烟87 品种上部叶对氮素响应和再利用劣于K326 品种，但K326 品种成熟时间短且更易落黄，与这两个品种在黔东南产区实际的大田生产表现一致。通过对两个品种上部叶氨挥发中氮来源的研究发现，在生长发育前期两个品种氨挥发的氮源主要为土壤氮，而后期则为肥料氮，也印证了侯雪坤等［27］的研究结果，即烤烟前期生长发育吸收的氮素以肥料氮为主，后期土壤氮的比例逐步提高。表明上部叶的生长发育过程，特别是上部叶在生育后期对肥料氮的利用很少，土壤氮是上部叶氮素营养的主要来源，对上部叶的品质形成有重要影响。因此，针对黔东南的地形地貌和气候条件，在烟稻轮作（田烟）模式下对优质烤烟上部叶的生产应选择氮素响应不敏感、耐肥性高的品种，并且要选择土壤中全氮和速效氮含量中等的田块。

4 结论

黔东南烟区云烟87 和K326 两个品种烤烟氮素积累量和氨挥发量随生育期的推进均呈现先升高后降低的趋势，其中云烟87 氮含量低于K326，而云烟87 氨挥发量在各生育阶段均高于K326。两个品种烤烟上部叶氮积累来源于土壤氮的比例随生育期推进逐渐上升，而氨挥发的氮源主要来自肥料氮。两个品种烤烟上部叶氮素积累和氨挥发量存在极显著差异，云烟87 对氮素的吸收量和利用率低于K326。因此，黔东南烟区土壤氮对上部叶的氮素营养起主导作用，不同烤烟品种上部叶对土壤氮和肥料氮的利用率存在差异。