葡萄糖调节蛋白78及精浆生化与弱精子症的相关性研究

韦玉霞　李洁　庞晓霞　廖碧云　陈兴鸿　王俊利　陈学杰

【摘要】 目的 探究葡萄糖调节蛋白78（GRP78）和精浆生化指标（果糖和锌）與弱精子症的关系。

方法 选取80例弱精子症不育男性为弱精子症组，80名有生育史的健康男性为正常对照组，分别采用酶联免疫吸附法（ELISA）、5-B-PASA显色法、酶法检测所有研究对象血清中的GRP78蛋白水平和精浆中的锌及果糖等指标，分析这三项指标与男性弱精子症的关系。

结果 弱精子症患者组的血清GRP78蛋白的表达水平和精浆果糖表达量显著低于正常对照组，差异有统计学意义（P<0.001），而精浆中的锌表达量在两组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。轻度弱精子症组（20%≤PR<32%）、中度弱精子症组（10%≤PR<20%）和极重度弱精子症组（PR<10%）的精浆果糖含量和血清GRP78蛋白表达量与正常对照组比较差异有统计学意义（P<0.05），且精浆果糖和血清GRP78含量在正常对照组、轻度弱精子症组、中度弱精子症组和极重度弱精子症组有递减趋势。

结论 血清GRP78蛋白以及精浆果糖表达量的检测有助于弱精子症的临床诊断，有可能作为弱精子症严重程度评估的参考指标。

【关键词】 葡萄糖调节蛋白78;果糖;锌;弱精子症

中图分类号：R698+.2 文献标志码：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2019.11.003

Relationship between glucose regulatory protein 78 and seminal plasma biochemistry and male asthenospermia

WEI Yuxia1，4，LI Jie2，PANG Xiaoxia2，LIAO Biyun4，CHEN Xinghong4，WANG Junli4，CHEN Xuejie1

（1.Guangxi Medical University，Nanning 530001，China;2.Department of Laboratory Medicine of Xingyi Peolples Hostpital，Xingyi 562400，China;3.Graduate School of Youjiang Medical University for Nationalities，Baise 533000，China;4.Reproductive Medicine Center，Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities，Baise 533000，China）

【Abstract】 Objective To explore the relationship between glucose regulatory protein 78（GRP78） and seminal plasma biochemical indicators（fructose and zinc） and asthenospermia.

Methods 80 infertile men with asthenospermia were selected as asthenospermia group and 80 healthy men with reproductive history as normal control group.ELISA，5-B-PASA and enzymatic methods were respectively used to detect the levels of serum GRP78 protein and the contents of zinc and fructose in seminal plasma for the relationship between indicators and male asthenospermia.

Results The expression level of GRP78 protein in serum and fructose in seminal plasma of asthenospermia patients was significantly lower than that of normal control group，and the difference was statistically significant（P<0.001），but no significant difference was observed in the expression of zinc in seminal plasma between the two groups（P>0.05）.Statistical difference（P<0.05） was also found in the expression of fructose in seminal plasma and GRP78 in serum of mild between normal group and asthenospermia group（32%>PR≥20%），moderate asthenospermia group（20%>PR≥10%） and severe asthenospermia group whose fructose expression in seminal plasma GRP78 in serum showed a tendency of decrease.

Conclusion The detection of GRP78 protein and fructose expression in seminal plasma is helpful for the clinical diagnosis of asthenospermia，and may be used to assess the severity of asthenospermia.

【Key words】 GRP78;fructose;zinc;asthenospermia

不孕不育症已逐渐成为全球共同关注的健康问题，影响着全球15%～20%的育龄夫妇。这些不孕不育患者中男性因素引起的不育大约占50%，而获得性和先天性精子异常是男性不育的重要因素[1]。作为精子质量异常最常见的类型，弱精子症是引起男性不育的主要因素之一。弱精子症的特征是新鲜精液中的精子数量正常但精子活力降低，可能由泌尿生殖系统感染、精索静脉曲张异常、精液液化、激素异常等原因引起。葡萄糖调节蛋白78（glucose regulated protein 78，GRP78）又称为免疫球蛋白重链结合蛋白，是热休克家族的成员。作为一种内质网应激的关键伴侣蛋白，GRP78主要参与蛋白质的合成、转运、折叠，维持蛋白质的正确构象，通过与内质网应激原件的结合抑制内质网应激的活化，对细胞发挥保护作用[2]。近年来，有研究发现GRP78蛋白的异常表达与多种生殖系统疾病的发生发展密切相关[3～5]。我国学者申树林等[6]研究证实，GRP78蛋白在正常精子中高表达，而在弱精子中低表达。进一步研究表明外源性GRP78作为分子伴侣，可能是通过调节精子细胞内Ca2+水平影响精子的运动。国外学者Visconti等[7]研究认为蛋白质磷酸化是精子获能相关的细胞内重要条件之一，GRP78可能作为蛋白质磷酸化激活因子通过CAMP信号途径使精子获能，认为GRP78是维持精子活力的重要调节因子。在本研究中，我们将探讨GRP78血清表达情况和精浆生化水平与弱精症的相关性，以期为弱精子症的诊断寻找新的诊疗靶点。

1 资料与方法

1.1 对象选取

研究对象均来自2018年2～7月右江民族医学院附属医院生殖医学中心男科病人，以前向运动精子百分率（PR%）<32%、其他精液常规参数正常的不育患者为弱精子症患者组80例，其未采取避孕措施，婚后性生活正常，不育年限超过1年，排除女方因素。根据WHO《人类精液检查与处理实验室手册》（第5版）精子活力分级标准，以精子PR%为标准对男性精子活力进行分级，其中PR%≥32%为正常对照组，PR%<32%为弱精子症组，再将弱精子症患者按PR%大小分为轻度弱精子症组（20%≤PR<32%）、中度弱精子癥组（10%≤PR<20%）和极重度弱精子症组（PR<10%）。同时选取同一时期到我院生殖中心男科就诊的80名已正常生育且精子前向运动百分率≥32%、精液常规检查结果正常的健康男性为正常对照组。所有患者均已签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 精液常规分析

所有研究对象禁欲3～7 d，通过手淫法采集全部精液于干净的取精杯中，精确测量精液体积，置于37℃水浴孵育。液化后的精液使用西班牙SCA精液分析系统进行常规精液分析，用Diff-Quik快速染色进行镜下精子形态分析。

1.2.2 精浆生化分析

将精液标本经离心速度为3000 rpm离心20 min，取上层精浆用于生化指标的检测。精浆中的锌含量检测采用5-B-PASA显色法，果糖含量检测采用酶法。试剂均来自深圳博锐德公司精浆生化系列检测试剂盒。仪器使用美国Awareness公司ChemWell2910全自动生化免疫分析仪。

1.2.3 GRP78蛋白的提取

静脉抽取研究对象外周血3.0 mL，室温自然凝固10～20 min，以离心速度为3000 rpm离心20 min，分离血清后分装于干净试管，置于-20℃冰箱保存备用。

1.2.4 GRP78蛋白含量的检测

将置于-20℃的血清标本置于室温自然解冻，后采用酶联免疫吸附法（ELISA）进行GRP78蛋白的检测。试剂盒为上海酶联生物科技有限公司生产，检测仪器为RT-6000酶标分析仪。

1.3 统计学方法

采用统计学软件SPSS 17.0对所得实验数据进行统计分析。计量资料符合正态分布以（±s）表示，两组之间的比较采用成组t检验，不符合正态分布采用秩和检验。四组间的数据比较采用单因素方差齐性分析，均数间的多重比较采用SNK法。检验水准：α=0.05，双侧检验。

2 结果

2.1 研究对象的临床特征

经统计分析，研究对象中弱精子症组和正常对照组的平均年龄分别为（34.09±6.18）岁和（33.18±6.46）岁，两组的精子浓度、精液量、精液pH值均在正常值范围之内，差异无统计学意义（P>0.05）。正常对照组的精子前向运动百分率、非前向运动百分率高于弱精子症组，不动精子百分率低于弱精子症组，比较差异有统计学意义（P<0.001）。见表1。

2.2 精浆锌、果糖、GRP78蛋白含量在弱精子症组和对照组的比较

经统计分析，正常对照组的精浆果糖含量和血清GRP78蛋白水平表达量显著高于弱精子症组，且两组间比较差异有统计学意义（P<0.001），而弱精子症患者精浆锌含量与正常对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

2.3 不同精子PR%组的精浆果糖、精浆Zn和血清GRP78水平比较

进一步分析正常对照组、轻度弱精子症组、中度弱精子症组和极重度弱精子症组的精浆果糖、锌和血清GRP78水平，并采用SNK法对组间进行两两比较。结果显示，正常对照组的精浆果糖含量和血清GRP78蛋白表达量均显著高于轻度、中度和极重度弱精症组（P<0.05）;而轻度弱精子症组、中度弱精子症组和极重度弱精子症组两两比较差异无统计学意义（P>0.05）;精浆Zn含量在正常对照组与轻度、中度以及极重度弱精子症组两两比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表3。且精浆果糖和血清GRP78含量在正常对照组、轻度弱精子症组、中度弱精子症组和极重度弱精子症组有递减趋势，即随着弱精子症严重程度的增加其GRP78蛋白水平有不同程度的下降，如图1所示。

3 讨论

GRP78属于热休克蛋白70家族成员之一，作为一种分子伴侣在蛋白质的折叠和转运过程及内质网应激反应中发挥重要作用。有研究已证实 GRP78在人和小鼠睾丸及附睾中精子发生时期表达[8～10]，且其表达异常可能与男性生殖系统疾病密切相关。在本研究中，我们发现弱精子症组的血清GRP78蛋白表达量显著低于正常对照组，与申树林等[6]研究结果相一致。为验证GRP78水平是否影响精子活力，本研究参照《WHO人类精液检查与处理实验室手册》（第5版）标准，以精子PR%将研究对象分为四组（正常对照组、轻度弱精子症组、中度弱精子症组和极重度弱精子症组），并分析各组之间血清GRP78蛋白表达水平的差异，结果显示，正常对照组的血清GRP78蛋白水平明显高于轻度、中度、极重度弱精子症组，提示血清GRP78水平可能与弱精子症发病存在一定关系。此外，我们还发现随着弱精子症严重程度上升，血清GRP78蛋白含量呈下降趋势，进一步表明该蛋白可能与精子活力高低有关，提示GRP78可能是维持精子活力的重要调节因子。目前，尚缺乏检测GRP78蛋白水平的成熟方法。申树林等[6]用双向电泳凝胶分析法发现GRP78在正常精子蛋白中高表达、在弱精子症蛋白中低表达，并采用Western-Blot法进一步证实这一现象，上述方法检测较繁琐，且成本较高。本研究参考GRP78在多发性骨髓瘤、鼻咽癌和神经精神系统性红斑狼疮等疾病的有关报道[11～13]，采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验测定血清样本GRP78 蛋白水平，该方法操作较简便且成本低于申树林等的研究方法，因此，该方法可能适用于科学研究以及临床应用。

精浆是精子发育、成熟的内环境，起着中和、缓冲、保护精子的作用。精浆中各生化指标的变化会影响精子质量和受精能力，因此，精浆生化检查对评估男性生育的影响有重要意义。锌是体内合成多种酶的主要成分，与精子的发生、成熟、运输及在女性生殖道内移动和获能密切相关，当机体内锌含量缺乏时，合成睾丸素酶发生紊乱，造成精子活动力下降;锌还可以延缓精子细胞膜的脂质氧化，起到维持细胞膜结构的稳定性和通透性作用，从而保持精子活力[14]。关于精液参数与精浆锌的相关性，一些研究者认为精浆锌水平与精子浓度、活力有关，如我国学者刘海儒等[15]研究发现精浆锌含量与精子总数、前向运动精子总数和IVF受精率关系密切，精浆锌含量是评估男性生殖力的重要指标之一。然而，有研究者却得出相反的结论，如张东梅等[16]研究发现精浆锌含量降低可导致精子密度下降，但对精子活力和形态没有显著影响。目前结论尚未统一。本研究结果显示弱精子症患者精浆锌含量与对照组相比无显著差异，可能是由于精浆锌含量较低，其组间差异和相关性在小样本检测中不易被发现。精浆果糖由精囊腺分泌，是精子获能的主要来源，精囊腺功能紊乱时，果糖含量降低，引起精子活动力下降，导致弱精子症。本研究分析表明，果糖含量降低时，精子活力亦下降，二者呈正相关。

近年来，在治疗弱精子症中常采用精子体外处理技术来提高精子的运动能力和穿透力。

本研究结果表明，GRP78蛋白表达水平可能是影响精子运动能力的一个重要因素。但本研究仅间接揭示了GRP78水平与精子PR百分率的关系，尚未对GRP78影响精子PR百分率的具体机制进行研究。此外，通过研究，发现GRP78蛋白水平和精浆果糖水平与弱精子症存在一定的相关性，表明GRP78与精浆生化联合检查对评估男性生育能力有一定的意义。但是有关GRP78 影响精子活动力的具体机制仍有待进一步研究。

参 考 文 献

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（收稿日期：2019-09-23 修回日期：2019-10-28）

（编辑：潘明志）

基金项目：广西自然科学基金面上项目（2018GXNSFAA050034）;广西卫生和计划生育委员会自筹经费科研课题（Z20170234，Z20170236）;广西教育厅高校中青年教师基础能力提升项目（2018KY0437）

作者简介：韦玉霞，女，主管技师，在读硕士研究生，研究方向：生殖免疫。E-mail：359627186@qq.com

通信作者：陈学杰。E-mail：xuejiechen1970@126.com

[本文引用格式]韦玉霞，李洁，庞晓霞，等.葡萄糖调节蛋白78及精浆生化与弱精子症的相关性研究[J].右江医学，2019，47（11）：810-814.