卵巢过度刺激综合征大鼠模型的建立*

莫 毅 刘 超 崔士龙 李 冰 苏立波 李云娟 王 娟 乃东红 谢 英

(1.广西壮族自治区计划生育研究中心科教科，南宁 530021)(2.河北省实验动物重点实验室，河北医科大学实验动物学部，石家庄 050017)(3.广西壮族自治区计划生育研究中心临床科，南宁 530021)

卵巢过度刺激综合征(ovarian hyperstimulation syndrome，OHSS)是由于在体外受精-胚胎移植(IVF-ET)周期中对不孕不育患者进行诱发排卵而引发的一种医源性并发症，严重时可危及患者生命[1]。OHSS的临床表现包括卵巢肿大、腹水、恶心、呕吐、电解质紊乱、低血容量、少尿、肾功能衰竭、胸腔积液、血液栓塞等。OHSS的标志性病理生理改变就是毛细血管通透性增加，从而导致严重渗出、卵巢体积增大、腹水、胸水、心包积液；而低血容量则引起少尿、血液浓缩导致血栓形成，进一步引起肾衰、急性呼吸窘迫综合征，甚至导致死亡[2-4]。研究数据显示约有20%～30%的IVF患者会罹患轻度OHSS，重度OHSS的发生率则高达2%～3%。然而OHSS的发病机制至今尚不明确，因此在积极探寻OHSS有效预防和治疗方法的同时，明确其发病机制至关重要[5]。

动物模型是医学研究中用于理解疾病发生机制和探索药物治疗效果的一种非常重要的研究工具。目前OHSS小动物模型以大鼠模型为主，3～5周龄的Wistar和SD大鼠均曾被用于OHSS大鼠模型的制备，但效果不一致[6-8]。本文将应用不同品系和周龄的大鼠进行OHSS模型的建立并进行比较，以期为后续的OHSS发病机制研究及治疗药物的开发提供一种可靠稳定的动物模型。

1 材料与方法

1.1 实验动物

3～5周龄SPF级雌性Wistar大鼠和雌性SD大鼠共60只，购自河北省实验动物中心，实验动物使用许可证号：SCXK(冀)-2018-008。动物均饲养于屏障环境，自由饮食，室温控制在22～24 ℃，相对湿度为40%～70%，明暗周期12 h:12 h。

1.2 实验动物分组

将动物按品系和周龄分成4组，分别是4周龄wistar大鼠组、3周龄SD大鼠组、4周龄SD大鼠组、5周龄SD大鼠组。再将每组的15只动物进行随机编号，分作3个处理组，分别是过度刺激(OHSS)处理组、常规(mild OHSS)处理组和对照组(Control)。

1.3 主要试剂

伊文思蓝购自索莱宝科技有限公司，使用时用生理盐水配制成5 mmol/L的溶液；注射用孕马血清促性素(PMSG)、注射用人绒毛膜促性素(hCG)购自宁波三生生物科技有限公司；孕激素、雌激素和VEGF ELISA试剂盒均购自安徽巧伊生物科技有限公司。

1.4 给药方法

动物分组的当日定为第0天。第1～4日，过度刺激(OHSS)处理组和常规(mild OHSS)处理组均分别注射体积为0.2 mL的PMSG 10IU，对照组(Control)注射0.2 mL的生理盐水；第5日，OHSS组注射30IU hCG，mild OHSS组注射10IU hCG，对照组注射0.2 mL的生理盐水。注射hCG后的第48小时进行样品采集，具体实验日程安排见表1。

表1 实验动物分组及处理情况一览表Table 1 Experimental animal experimental grouping and treatment

1.5 样品采集

注射hCG后第48小时，称取动物体质量并记录，腹腔注射45 mg/kg体质量的巴比妥进行麻醉，内眦采血。分离血清并置于-20 ℃保存。采血后，通过尾静脉注射0.2 mL 5mmoL/L的伊文思蓝溶液并于注射后30 min用5mL生理盐水灌洗腹腔并收集灌洗液1 mL，在腹腔灌洗液中加入50 μL 0.1moL/L的NaOH溶液以清除蛋白质造成的混浊。收集腹腔灌洗液后立即无菌打开腹腔，暴露卵巢，拍照，取出卵巢并称其质量。取出的卵巢称其质量后立即放入盛有4 mL二甲基甲酰胺的试管中，65 ℃水浴孵育24 h。收集的腹腔液和卵巢孵育液均在经过900 g离心10 min后取上清检测660 nm处的吸光度(A)。

1.6 血清雌二醇(E2)、血管内皮生长因子(VEGF)和孕酮(P)水平测定

分离得到的大鼠血清采用ELISA的方法进行血清E2、VEGF和P水平测定，ELISA试剂盒购自安徽巧伊生物科技有限公司，按说明书进行操作，使用酶标仪测定相应的吸光度。

1.7 统计方法

采用SPSS9.0软件进行t检验分析，P<0.05则说明差异有统计学意义。

2 结果

2.1 外观观察

通过解剖动物后可以发现，全部4组经过度刺激(OHSS)处理、常规刺激(mild OHSS)处理的动物均可见明显的卵巢体积增大。并且所有经过度刺激处理(OHSS)的动物腋下均可见明显的毛细血管破裂并出现明显斑块(图1)。

图1 大体观察Fig.1 The overall observation of ovary and subcutaneous hemorrhage

2.2 体质量及各脏器质量

各组的卵巢指数的分析结果显示,全部4组经过度刺激(OHSS)处理、常规刺激(mild OHSS)处理的动物的卵巢指数均显著高于对照组 (P<0.01)，且3周龄SD大鼠组经常规刺激(mild OHSS)处理及过度刺激(OHSS)的卵巢指数均显著高于其他3组 (P<0.05)。但各组及处理组间肾脏指数无显著差异，见表2，图2。

图2 各组及处理组间脏器指数比较Fig.2 Comparation of the ovary and kidney index

表2 各组大鼠的卵巢、肾脏指数Table 2 Comparation of the ovary and kidney index

2.3 血液中孕激素、雌激素及VEGF浓度的比较

结果显示，除4周龄Wistar 过度刺激(OHSS)处理组大鼠的血清VEGF水平和3周龄SD过度刺激(OHSS)处理组大鼠的血清雌激素水平高于对照组(Control)，差异显著(P<0.05)；及3周龄SD过度刺激(OHSS)处理组大鼠的血清VEGF水平高于对照组(Control)，差异极显著(P<0.01)外，其余各组内不同处理间大鼠血清的雌激素、孕激素和VEGF水平均无显著差异(P>0.05)，见表3、图3。

表3 不同组大鼠血清中孕激素、雌激素及VEGF含量Table 3 Comparison of serum levels of progesterone，estrogen and VEGF in different groups

图3 各组及处理组间血清孕激素、雌激素和VEGF水平的比较Fig.3 Comparison of serum levels of progesterone estrogen and VEGF in each group and treatment group

2.4 3周龄SD大鼠血管通透性改变

注射hCG后，3周龄SD大鼠中OHSS处理组的腹腔液中伊文思蓝浓度显著高于Mild OHSS组和Control组(P<0.05)，同时卵巢中的伊文思蓝浓度也显著高于其他两组(P<0.05)，见图4。

图4 3周龄SD大鼠腹腔液和卵巢中伊文思蓝浓度Fig.4 Evans blue concentration of peritoneal fluid and ovary in 3-week-old SD rats

3 讨论

OHSS 是在超数排卵过程中最常见的一种临床并发症，严重时可危及生命。OHSS 发生的病理生理机制尚未完全阐明,一般认为本病发生的主要诱因是由hCG刺激卵巢分泌并释放血管活性物质而导致毛细血管通透性增加[9]。本实验参照了国内、外多个实验室的造模经验,应用不同剂量的hCG对不同周龄和不同品系的大鼠进行刺激后发现所有不同周龄的大鼠用于造模的效果不尽相同。数据结果显示，处于青春前期的3周龄SD大鼠更适用于进行OHSS大鼠模型的建立，3周龄SD大鼠在PMSG联合hCG作用下出现了明显的卵巢增大，血管通透性增加，血清VEGF水平上升等OHSS典型改变。造模过程中大量使用的hCG可以刺激颗粒细胞分泌VEGF，大量分泌的VEGF则可以使血管通透性增加，进而导致患有OHSS的个体出现腹水、血容量减低等症状。VEGF在OHSS的发病机制中起着至关重要的作用[10-12]。因此血清VEGF可以作为一种检测OHSS大鼠模型构建是否成功的标志性分子。与其他各组相比较，3周龄SD大鼠OHSS处理组的动物血清VEGF水平显著高于Mild OHSS组和Control组，3组间差异显著(P<0.05)；而其他年龄或品系的大鼠组间VEGF水平则差异不显著(P>0.05)。由此可见，3周龄SD大鼠更为适合用于OHSS模型的构建。

与人类的OHSS表现进行比较，通过注射一定剂量的的hCG而构建的大鼠OHSS模型同样会出现卵巢体质量明显增加，血管通透性增加，血清VEGF含量明显增加等症状。但是由于大鼠OHSS模型在某些生化指标和生理指标方面仍旧未进行详细的量化指标评价，因此本文中利用3周龄SD大鼠构建OHSS模型虽取得了初步成功，但仍有待进一步探讨。