红酵母固态发酵农林废弃物接种量对菌体生长及营养成分的影响

苗欣宇，牛红红，李 达，郑 丽，迟燕平，苏 颖，刘佳彤，王景会

（吉林省农业科学院农产品加工研究所，吉林长春 130033）

0 引言

红酵母，属于隐球酵母科[1]。其发酵产物中含有β-胡萝卜素[2]、红酵母红素[3]和γ-胡萝卜素[4]等多种类胡萝卜素成分，在发酵过程中分解大分子蛋白质和糖类化合物。类胡萝卜素是一类黄色或红色的多烯类化合物，均有抗氧化性[5]，能有效抑制细胞中生物大分子被自由基损害，起到抗衰老、提高免疫能力的作用。有研究证明，类胡萝卜素可以保护细胞、抑制慢性退行性疾病的发生，以及抑制正常体细胞的变异、肿瘤细胞的生长，并且在促进儿童身体发育方面有重要作用[6]。然而，人体和动物体内不能自主合成类胡萝卜素，只能从食物中摄取，已经有很多国家允许类胡萝卜素添加剂用作食品营养强化剂、饲料增色剂[7]等。

近年来，国内对红酵母属的研究越来越丰富，尤其是红酵母的发酵工艺和发酵产物的活性成分研究颇多。赵笛[8]通过优化酸热破壁条件对红酵母细胞进行破壁，最终使虾青素的提取率达到911.6 μg/g，并研究向培养基投放前体物质对菌体生长及色素积累的影响。Tapingkae W等人[9]在鸡饲料中添加红酵母，酵母补充组的蛋黄颜色变深，HMG-CoA还原酶活性显著降低，降低了血清和蛋黄中的胆固醇含量。红酵母发酵可以增加饲料中的类胡萝卜素，增强抗氧化能力，可增强机体的免疫能力，提高禽蛋的品质和风味[10]，并可以改善肉鸡的肠道形态结构及提高肉鸡生产性能和屠体性能[11]。此外，新疆的哈萨克族牧民在用骆驼乳生产酸骆驼乳中可以分离出一株红酵母，其可以增加骆驼乳中的营养价值，并起到抗菌、抑霉的作用[12]。

试验以农林废弃物，豆粕、麸皮和酒糟混合制成固体培养基，利用从土壤中筛选出的一株红酵母CCYZ116进行固态发酵。经过红酵母的发酵，研究固体培养基中的类胡萝卜素含量、可溶性蛋白含量和可溶性糖含量的变化，进一步为农林废弃物回收再利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红酵母，吉林省农业科学院食品微生物实验室在吉林省长春市净月区的土壤中分离鉴定提供，并保藏命名为CCYZ116。

斜面培养基：200 g/L马铃薯，20 g/L葡萄糖，20 g/L琼脂。

液态发酵培养基：10 g/L蛋白胨，10 g/L酵母浸粉，40 g/L葡萄糖。装液量为50 mL于250 mL三角瓶中。

固态培养基：将酒糟、豆粕和麸皮研磨至40目，酒糟∶豆粕∶麸皮配比为1∶3∶2，按比例称好培养基，均匀搅拌，分别取50 g置于500 mL烧杯中，封口包扎，于121℃下灭菌40 min[13]。

1.2 仪器与设备

MLS-3780型高压蒸汽灭菌锅，日本Sanyo公司产品；HZQ-X100型全温振荡培养箱、DHP-9272型电热恒温培养箱，上海一恒科技有限公司产品；Cary 300型紫外可见光分光光度计，美国Varian公司产品；Evolution RC型高速冷冻离心机，美国Thermo Stovall公司产品；DL-CJ-2ND型超级洁净工作台，北京东联哈尔仪器制造有限公司产品。

1.3 方法

1.3.1 种子培养

CCYZ116种子培养：在CCYZ116斜面上挑取菌落，接种于液体培养基中。温度为30℃，以转速230 r/min振荡培养48 h。

接种量不同处理：

（1） 空白组。接入15 mL灭菌蒸馏水为空白对照，于30℃下培养72 h。

（2） 原液培养组。将15 mL CCYZ116液体发酵液离心，弃上清，用15 mL灭菌蒸馏水水重悬接入固体培养基中，于30℃下培养72 h。

（3） 2.5倍浓缩培养组。将37.5 mL CCYZ116液体发酵液离心，弃上清，用15 mL的灭菌蒸馏水水重悬接入固态培养基，于30℃下培养72 h。

（4） 5倍浓缩培养组。将75 mL CCYZ116液体发酵液离心，弃上清，用15 mL的灭菌蒸馏水水重悬接入固态培养基，于30℃下培养72 h。

1.3.2 有效活菌数的测定

采用平板计数法测定有效菌数，每个发酵烧杯搅拌均匀，取5 g加入50 mL无菌水，于摇床中以转速230 r/min振荡摇匀30 min，制成CCYZ116悬液。取稀释至10-4，10-5，10-6倍的菌悬液100 μL于斜面培养基中，30℃培养48 h，对长有30～300个菌落的平板计数。单位：CFU/g。

1.3.3 生物量检测方法

将5倍于培养物质量的无菌蒸馏水加入到发酵杯中，分次洗涤。用4层纱布依次滤掉杂质，得到菌液。将菌液以转速3 500 r/min离心15 min，得到湿菌体。将CCYZ116菌体移至预先干燥至恒质量的称量杯中，于50℃下烘干至恒质量，用分析天平称量CCYZ116菌体总质量[14]。

CCYZ116菌体生物量计算公式：

式中：W——CCYZ116菌体生物量，g/L；

M——称量瓶与菌体的总质量，g；

M0——称量瓶的质量，g；

V——所取滤液量，mL，一般取10 mL。

1.3.4 类胡萝卜素的测定方法

采用酸热破壁法[15]。在上述1.3.3方法获得的湿菌体10 mL中加入10 mL的3 mol/L HCl溶液。将酸溶液在室温下振荡浸泡45 min，沸水浴煮沸4～5 min后迅速冷却。

酸热破壁后的CCYZ116酸溶液，以转速4 000 r/min离心15 min，沉淀用无菌蒸馏水反复洗涤2次，加入10 mL丙酮。丙酮溶液于室温下振荡1 h提取类胡萝卜素后，以转速4 000 r/min离心15 min，得到上清液即为类胡罗卜素提取液。如若离心的沉淀还有颜色残留，则说明细胞碎片中仍有色素未提取出，可再加丙酮再提取。用分光光度计测定适当稀释后的浸提液于波长450 nm下的吸光度[16]。类胡萝卜素含量计算公式为：

式中：Wc——发酵液类胡萝卜素含量，μg/g；

Amax——最大吸收波长450 nm下的吸光度；

D——测定试样的稀释倍数；

V——提取色素用有机溶剂体积，mL；

m——干酵母菌体质量，g；

0.16——类胡萝卜素的摩尔消光系数。

类胡萝卜素产量计算公式：

类胡萝卜素产量（μg/L） =Wc×W.

式中：Wc——发酵液类胡萝卜素含量，μg/g；

W——CCYZ116菌体生物量，g/L。

1.3.5 可溶性蛋白含量检测方法

采用凯氏定氮法测定[17]。

1.3.6 可溶性糖含量检测方法

采用苯酚浓硫酸法测定[18]。

2 结果与分析

2.1 不同接种量对活菌数和菌体生物量的影响

不同接种量对活菌数和菌体生物量的影响见表1。

表1 不同接种量对活菌数和菌体生物量的影响

由表1可知，5倍浓缩组的培养基中的活菌数最高达到了3.64×108CFU/g，菌体生物量最高达到2.644 g/L；2.5倍浓缩组的活菌数为3.60×108CFU/g，菌体生物量最高达到了2.699 g/L，两组之间没有显著差异。但与原液培养组和空白组比较差异显著（p＜0.05）。结果表明，接种量的增加，显著提高了培养基的活菌数量和菌体生物量，但浓缩倍数达到2.5倍时对活菌数量和菌体生物量的影响已饱和，不是接菌量越大活菌数量就越高。在实际发酵应用中可适当加大接菌量，达到饱和点后无需再继续加大接菌量，既可提高发酵效率，又能降低成本。

2.2 不同接种量对类胡萝卜素含量的影响

不同接种量的CCYZ116固态发酵饲料，对发酵产物中类胡萝卜素含量的影响。

不同接种量对类胡萝卜素含量的影响见图1，不同接种量对类胡萝卜素产量的影响见图2。

由图1可知，5倍浓缩组的类胡萝卜素含量最高达到了713.22 μg/g，类胡萝卜素产量最高，达到了1 312.3 μg/L。与2.5倍浓缩组、原液培养组和空白组相比，均显著提高了发酵产物中的类胡萝卜素含量和产量 （p＜0.05）。

接种量的不同影响着酵母的生长和发酵产物组分，适宜的接种量可以促进CCYZ116菌体生长，增加菌体生物量。但是，菌体生长的最适接种量与类胡萝卜素产量的最适接种量不同。王蓉等人[19]研究表明，红酵母WP3生长和类胡萝卜素产量最高的发酵条件是不同的。发酵过程中，影响CCYZ116菌体生长和类胡萝卜素产量的因素还不明确，需要进一步研究探讨。

类胡萝卜素可在植物、动物和微生物的生长繁殖过程中起到关键的作用。目前，生产应用中80%～90%的类胡萝卜素是通过化学合成的，市场上对于天然的类胡萝卜素的需求量与日俱增。农林废弃物经过红酵母CCYZ116的发酵产生了大量的天然类胡萝卜素，丰富了其营养成分。经过发酵的农林废弃物，可制作增色饲料，用于水产养殖和家禽养殖等[20-21]。

图1 不同接种量对类胡萝卜素含量的影响

图2 不同接种量对类胡萝卜素产量的影响

2.3 不同接种量对可溶性蛋白和可溶性总糖含量的影响

不同接种量对可溶性总糖含量的影响见图3。

图3 不同接种量对可溶性总糖含量的影响

由图3可知，2.5倍与5倍浓缩组的可溶性总糖含量分别达到了5.433，5.309 g/100 g，与原液培养和空白组相比显著提高了饲料中的可溶性总糖含量（p＜0.05）。然而2.5倍浓缩组与5倍浓缩组之间没有显著性差异。说明2.5倍的接种量使培养基中可溶性蛋白达到了阈值，在实际应用中无需5倍接种量，以节省成本。

经韩梅等人[22]对红酵母发酵产物中类胡萝卜素、蛋白质和脂肪酸的成分进行分析，表明经过红酵母的发酵后，培养基产生更丰富的氨基酸和脂肪酸，提高培养基的营养价值。

不同接种量对可溶性蛋白含量的影响见图4。

图4 不同接种量对可溶性蛋白含量的影响

由图4可知，2.5倍浓缩、5倍浓缩组和原液培养组，与空白组相比，均显著提高了可溶性蛋白含量（p＜0.05）。原液组的可溶性蛋白含量最高达到了10.392 g/100 g，显著地提高了可溶性蛋白含量（p＜0.05）。说明原液组的接种量在发酵过程中培养基中可溶性蛋白含量最高，接种量的增加反而会降低可溶性蛋白含量，这种结果产生的原因和机制需进一步研究。

3 结论

利用从土壤中分离出一株红酵母的发酵作用来增加农林废弃物的营养成分。研究不同接种量的CCYZ116固态发酵后农林废弃物培养基中菌体生长和营养成分的变化。2.5倍浓缩组与空白组、原液组相比显著地提高了培养基中活菌数（3.64×108CFU/g）和生物量（2.699 g/L，p＜0.05）。5倍浓缩组的类胡萝卜素含量 （713.22 μg/g） 和产量 （1 312.3 μg/L） 最高，2.5倍浓缩组的可溶性总糖最高达5.433 g/100 g，原液组的可溶性蛋白含量最高为10.392 g/100 g（p＜0.05）。

由此可见，提高红酵母的接种量，有助于提高红酵母发酵产物的营养价值、提高发酵效率、降低成本，为农林废弃物回收利用和红酵母实际应用的进一步研究和开发提供了理论依据。