油酸致急性呼吸窘迫综合征大鼠肺组织KLF2蛋白表达的研究

钟红平，袁 强，冯孝强，王娟娟*，陈彦香

(1.延安大学附属医院儿科；2.延安市人民医院儿科，陕西延安716000；3.宁夏银川市第一人民医院新生儿科，宁夏银川750001)

新生儿呼吸窘迫综合征(Neonatal respiratory distress syndrome,NRDS)是指早产儿出生后不久即出现进行性呼吸困难和呼吸衰竭等症状，主要由于肺泡表面活性物质(Pulmonary Surfactant,PS)缺乏引起通气、换气功能障碍[1]，在临床上又称为肺透明膜病[2]，常表现为呼吸费力、次数增多，发绀等，严重者出现呼吸停止及衰竭，甚至死亡。该病生后6 h内出现吸窘迫，并呈进行性加重，是新生儿生后3 d内死亡的主要原因之一[3]。随着外源性PS在临床中的应用，疾病死亡率降低了30%左右，但仍有部分患儿预后较差，表明PS缺乏并非新生儿呼吸窘迫综合征的唯一因素[4]。近年来对NRDS的发病机制主要集中到对肺泡整体细胞功能的调控上，尤其是肺泡Ⅰ型细胞的功能调控越来越受到重视，本文主要通过研究RDS大鼠肺组织中的I型标记物KLF2蛋白的量变化，进而探讨I型标记物KLF2蛋白与呼吸窘迫综合征的关系，为难治性NRDS患儿发病机制提供可能的理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

健康雄性SD大鼠32只，体重约(193.49±9.01)g。实验原料主要为医用油酸，实验仪器微量进液器、手术剪刀、止血钳、镊子、玻璃分针，液氮罐，水浴锅，旋转摇床，微波炉，通风厨。PBS(pH 7.2)∶柠檬酸盐缓冲液，3%甲醇/H2O2溶液，中性树胶牛血清白蛋白(BSA)等。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及造模 将32只SD大鼠随机分为对照组、3 h、18 h、24 h组，每组8只，将大鼠固定于固定器中，酒精棉球消毒鼠尾，实验组大鼠用微量泵通过尾静脉注射0.17 mg/kg油酸，制成RDS动物模型。分别于注射油酸3 h、18 h、24 h后用水合氯醛通过腹腔麻醉大鼠，消毒大鼠胸部，用剪刀沿胸正中线剪开胸腔，取下肺叶，最后石蜡包埋，放入液氮罐中低温保存。

1.2.2 Western blot检测 取出液氮罐中低温保存的肺组织样品，将取好的组织加入事先溶解有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的强效组织裂解液中，匀浆机低温匀速裂解后，置于离心机中4℃离心5 min(14000 r/min)，取出离心管并吸取上清液，使用BCA法进行组织蛋白定量。首先制备SDS-PAGE凝胶，采用上样针吸取20 μg变性蛋白，加至凝胶孔中，60 V电压条件下电泳30 min。将电压调至120 V，电泳至染料跑出分离胶，进行电泳蛋白转印及曝光，采取6 cm×8 cm的PVDF膜，甲醇浸泡至无气泡存在，双蒸水浸泡，置于转印缓冲液，备用；浸湿转印滤纸，切除浓缩胶，转印缓冲液浸泡5 min；然后按照滤纸-分离胶-PVDF膜-滤纸的顺序组装“三明治结构”，玻棒来回滚动，赶出气泡，将三明治结构置于转印槽中，加入适量转印缓冲液，将转印槽置于冰浴中，50 V电压转印120 min，小心取出转印后的PVDF膜,置于含5%BSA的PBST溶液中，缓慢摇动，室温封闭1 h；加入一抗，其中KLF2抗体按照1∶1000稀释，β-ACTIN按照1∶5000稀释，4℃冰箱孵育过夜，并缓慢摇动，取出PVDF膜，1×TBST溶液洗涤三次，10min/次，加入山羊抗兔二抗(中杉金桥ZB23011∶5000稀释)溶液，室温孵育60 min，用1×TBST溶液洗涤三次，10 min/次，再滴加1 mL ECL发光液，室温孵育5 min，置于化学发光仪曝光，采集图片，使用Image Pro软件分析印迹条带光密度值。

1.2.3 组化免疫检测 将实验组与对照组石蜡标本进行切面，将切片置于二甲苯中脱蜡，水化酒精溶液处理；取适量枸橼酸钠缓冲液加入到高压锅中，将微波功率调制最大，放入脱蜡水化的组织切片，将切片置于染色缸中，3%H2O2甲醇溶液灭活内源性过氧化物酶15 min；洗涤后用5%BSA的PBS溶液封闭1 h，滴加二抗(约50 μL)，室温密闭孵育1 h，用自然成熟的苏木精染液染核2 min，盐酸酒精溶液分化20 s，经梯度乙醇对切片脱水，最后滴加20 μL中性树胶，24×32 mm盖玻片封片；室温自然干燥，后行镜检。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 油酸致呼吸窘迫综合征大鼠结果

32只大鼠用微量泵通过尾静脉注射0.17 mg/kg油酸后，大约5～10 min出现轻度呼吸窘迫综合征样症状，如呼吸急促，易惊等表现，并伴有粉红色泡沫样肺水肿液由鼻腔溢出，快速取出肺组织见肺实体颜色暗红，不光滑，有散在瘀点，成功制成RDS大鼠。

2.2 RDS大鼠与正常大鼠肺组织KLF2表达量的比较

Western blot结果显示油酸18 h组、24 h组肺组织中的I型标记物KLF2蛋白的量与对照组大鼠数据比较差异有统计学意义(P<0.05)，而油酸3 h组与对照组差异无统计学意义(P>0.05)，具体数值见表1所示。免疫组化结果显示，KLF2蛋白在各组不同时间段肺组织量的表达，相比对照组图，18 h组和24 h组显示KLF2蛋白减少，而3 h组KLF2蛋白减少不明显(见图1)。

表1 大鼠KLF2蛋白表达对比

注：*与对照组P<0.05

3 讨论

当前儿科界医生普遍认为NRDS的发病是由于肺泡Ⅱ型细胞中的PS分泌不足引起，近年来研究者们对肺泡Ⅰ型细胞的功能有新的认识，他们认为肺泡I型上皮细胞的功能在NRDS的发病机制中也起着重要的作用[5]。研究证明[5]I型肺泡细胞负责进行气体交换，Ⅱ型肺泡细胞在肺部功能是分泌PS，降低肺表面张力。Pei等[6]在研究呼吸窘迫小鼠的动物实验中，发现它们的肺组织有早熟的I型肺泡，给这类小鼠加抗甲状腺素类药物能减少RDS的发生，认为甲状腺激素受体在小鼠肺发育很重要，继续研究认为甲状腺激素与甲状腺激素受体结合，最终能激活小鼠肺组织中的KLF2蛋白，它能促成I型肺泡细胞的成熟，无KLF2蛋白的小鼠会马上死亡，死亡的小鼠解剖发现有肺不张，免疫图片有稀少I型肺泡的扁平细胞，Ⅱ型样立方细胞正常，免疫组化显示小鼠肺组织中I型标记物蛋白明显减少，而SP-B，SP-C和PECAM-1染色判定Ⅱ型肺细胞和血管内皮细胞无影响，因此小鼠体内甲状腺素缺乏会影响KLF2蛋白生成，最终会影响I型肺泡细胞的发育和成熟，这说明I型肺泡细胞及其KLF2蛋白与呼吸窘迫综合征有关联。

在本实验中，主要研究大鼠肺组织中的I型标记物蛋白的变化关系，选择油酸18 h组、24 h组中大鼠，提取它们肺组织中的I型标记物KLF2蛋白的量与健康大鼠KLF2蛋白的量进行比较，P<0.05，有统计学意义；在本实验中，18 h、24 h RDS大鼠肺组织相比正常组I型标记物KLF2蛋白的量是减少的。本人在前期大鼠动物研究中发现，由油酸诱导的呼吸窘迫综合征大鼠的血清甲状腺素与健康大鼠的血清甲状腺素相比较是下降的，是符合统计学意义的[7]，再结合Pei等[6]小鼠的动物实验研究结果，说明小鼠的血清甲状腺素和I型肺泡细胞及其KLF2蛋白与其呼吸窘迫综合征是有一定的关联的。

在临床上导致NRDS发病多数与Ⅱ型肺泡细胞分泌的PS有关，但有些患儿用其治疗无效果，可能与I型肺泡细胞及甲状腺素受体缺乏有关，有的可能与基因缺乏等有关。本研究实验数据量较少，这需要在今后临床工作中继续积累病例，在动物实验中增加实验数据，需研究呼吸窘迫大鼠第二天乃至第三天KLF2蛋白的量，来明确大鼠血清甲状腺素与KLF2及呼吸窘迫的相关性，为明确NRDS患儿甲状腺素替代治疗提供理论依据。