血浆游离DNA在非小细胞肺癌诊断中的价值分析

王健 董栋 渠敬明 李龙飞 周厚文 吴秀娟（通讯作者）

（1 徐州市肿瘤医院肿防办/胸外科 江苏 徐州 221003 ）

（2 徐州医科大学公共卫生学院 江苏 徐州 221003）

肺癌为一种常见的恶性肿瘤，具有较高的病死率。肺癌结构中，85%属于非小细胞肺癌（NSCLCA），且NSCLCA患者中，70%发现时已经处于晚期，丧失最佳治疗机会[1]。因此对于NSCLCA需早期开展诊断，早期治疗提高治疗效果。血浆游离NDA为一种新发现的肿瘤标记物，有望在肿瘤疾病诊断中成为新的标记标准，因此本次重点分析NSCLCA患者检测血浆游离DNA临床意义，具体研究内容及结果如下。

1.资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年1月－12月期间我院收治的40例NSCLCA患者为研究组，患者经细胞学或者病理学诊断确定为NSCLCA，本次检测分析前患者均未进行手术、化疗以及放疗等抗肿瘤治疗。排除标准：病毒性肝炎；HIV等感染性疾病；全身系统性疾病等患者。腺癌患者21例，鳞癌患者19例；TNM临床分期中，Ⅰ期患者11例Ⅱ期10例，Ⅲ期16例，Ⅳ期期患者3例。40患者中男性患者26例，女性患者14例，年龄39～78岁，平均（55.3±3.5）岁。另选取同期进行健康体检的40例人群为对照组，男25例，女15例，年龄41～76岁，平均（50.1±2.9）岁，两组人员均自愿进行本次检测。两组人员年龄、性别构成比等基本信息纳入统计学分析软件中分析，差异无统计学意义，结果具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 采样 抽取清晨空腹静脉血5ml，离心机进行10min 3000r/min离心，吸取上层血浆转至无菌EP管中，然后在4℃12000r/min 下离心10min，吸取上清液置于-80℃冰箱中保存，以上操作在2h内进行完毕。

1.2.2 提取血浆游离DNA 采取QIAamp DNA Blood Midi Kit试剂盒按照说明书提取DNA。取血浆样本500ul，依次调节50ul蛋白酶、500ul Buffer AL 以及500ul乙醇，最后加入50ul的Buffer AE进行洗脱，将提取的血浆游离DNA置于-20℃冰箱中保存备用。

1.2.3 血浆游离DNA水平测定 上游引物为5/-CCACACTGTGCCCATCTACG-3/，下游引物为5/-AGGATCTTCATGAGGTA GTCAGTCAG-3/，扩充产物为99bp长度，上海工生物工程技术服务公司提供引物序列、将DNA模板以及样品分别配置RT-PCR反应体系，总反应体系为20ul，荧光PCR反应液为11ul，上下引物各1ul，DNA模板为1ul ddH2O 6ul，循环参数设置为95℃1min，95℃20s，60℃30s，68℃ 45s，进行40个循环反应。

1.2.3 标准曲线绘制[2]使用已知浓度的标准品绘制曲线，已知浓度获得的ct与DNA含量为对数关系，采取PCR自带分析软件根据样品ct获得相关浓度。

1.3 数据分析

数据采用SPSS20.0统计软件进行统计分析，计数资料采用率（%）表示，进行χ2检验，计量资料采用（±s）表示，进行t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2.结果

2.1 患者与正常人之间血浆DNA水平比较

正常人群的血浆DNA水平值为（12.06±3.85）ng/ml，患者水平为（201.56±83.66）ng/ml,组间差异显著（t=19.68,P=0.000）。

2.2 NSCLCA患者之间的血浆DNA水平比较

非小细胞肺癌患者中Ⅰ/Ⅱ水平低于Ⅲ/Ⅳ期（P＜0.05），其他因素之间水平差异无统计学意义（P＞0.05），见表。

表 NSCLCA患者之间的血浆DNAS水平值比较（±s，ng/ml）

表 NSCLCA患者之间的血浆DNAS水平值比较（±s，ng/ml）

资料血浆DNA水平tP性别男192.33±80.230.0390.065女201.23±97.65年龄（岁）≥60194.65±87.650.0450.061＜60205.66±89.66病理类型腺癌205.33±80.230.0210.085鳞癌199.68±81.23分期Ⅰ/Ⅱ170.23±71.223.1970.000Ⅲ/Ⅳ229.66±93.56

3.讨论

对于肺癌患者而言，手术仍是治疗最佳选择，但由于非小细胞肺癌起病隐匿，发现时多数处于晚期，失去手术最佳机会。随着医疗模式发展，新型化疗药物以及免疫抑制剂治疗水平获得明显提高，使得肺癌患者治疗方式出现更多选择，但肺癌患者5年生存率仅为15%左右，总体效果不理想[3]。因此对于非小细胞肺癌患者进行早期筛查并尽早治疗为最佳手段。

近年来肿瘤标记物在肿瘤疾病诊断中获得广泛应用，与影像学和病理学等见检查方式比较，肿瘤标记物检查具有操作简单、价格低廉以及预测效果准确等优点。游离DNA是一种含有DNA双螺旋系统的核苷酸片段，临床研究显示其是可能与多系细胞的凋亡相关，因此可通过该物质的水平值预测体内细胞凋亡情况[4]，因此可通过其水平值预测机体内细胞情况。本次研究中，健康人群体内血浆DNA水平值显著低于非小细胞肺癌患者，患者的水平值高于正常人群可能是由以下原因造成：肿瘤细胞的凋亡或者坏死；肿瘤细胞自身释放DNA；肿瘤细胞或者微转移灶产生。以上产生的DNA进入血浆后导致检测结果偏高。以上结果提示，后续早期非小细胞癌患者中可使用检测血浆DNA水平判断患者是否具有疾病，如水平值高于正常的10倍以上可怀疑为该疾病，应进行下一步检查。非小细胞肺癌患者中Ⅰ/Ⅱ水平值低于Ⅲ/Ⅳ期，其他因素之间水平差异无统计学意义，说明血浆DNA水平值可判断非小细胞肺癌患者疾病发展阶段，但对于疾病类型以及诱发疾病的危险因素无预测价值，本次研究结果与前人报道基本一致。经以上结果分析我们认为：血浆游离DNA在非小细胞肺癌疾病诊断及临床发展分析中均具有指导价值，但目前研究处于初级阶段，该水平因子的检测仍有具有一定局限性，临床实际应用中需要联合其他指标开展分析，提高诊断准确性。