同名经部位对称的少泽、至阴穴刺血法对孕鼠泌乳素、乳腺组织形态及子宫组织Cx-43蛋白表达的影响*

刘 佳，李子腾，郑 君

(1.济南市历城区中医医院，山东 济南 250100; 2.枣庄市薛城区中医院，山东 枣庄 277000; 3.山东中医药大学，山东 济南 250013)

同名经配穴法是指在同名经“同气相通”指导下，配伍手足同名经腧穴的方法[1]。临床治疗中选用腧穴的部位对称或部位形态相近其功能应当有相似之处或有很大的关联影响性[2]，这为“同气相通”理论赋予了形态学上的意义，但至今缺乏现代医学依据，对“同气相通”理论的探讨多限于思维方式和哲学层面的研究,造成其在具体指导临床时常缺乏准确性和稳定性。

少泽穴与至阴穴分别为同名手足太阳经的井穴，少泽是临床通乳的经验效穴，至阴是临床转胎的经验效穴。两者所处部位相似，部位的形态也相似，功能皆指向女性孕产疾患。本研究选取同名经部位对称的少泽、至阴穴点刺放血，观察不同穴位刺激对孕大鼠的泌乳素影响，同时，通过手足同名经井穴的效应差异，探讨“同气相通”理论的现代医学依据，提高经典理论的现代认同度，也能为临床调整女性内分泌激素提供新思路。

1 实验材料

1.1 实验动物

Wistar大鼠，清洁级(济南朋悦实验动物繁育有限公司提供)，体质量(250±20)g，饲养于山东省中医院的实验动物中心，室内温度24～26℃，相对湿度50%～70%，常规光照与黑暗光照交替下喂养，食物饮水充足。

1.2 主要试剂及仪器

10%水合氯醛溶液;低速自动平衡微型离心机(DT5-3,北京时代北利离心机有限公司);纯水仪(AJC-0501-P);紫外分光光度计(752-P);电泳仪(DYY-6C);感光胶片;微型旋涡混合器(WH-2);水浴锅(TL-420D);10 μL枪(DS74948);100 μL枪(DX15487);1 000 μL枪(DS93879);冰箱(BCD-186);全自动化学发光测定仪(Maglumi 800);泌乳素检测试剂盒(化学发光,深圳新产业);扫描仪(V300);灰度分析软件(alphaEaseFC);图像分析软件(Adobe PhotoShop);RIPA裂解液(G2002)、50×cooktail(G2006)、PMSF(100 mm,G2008)、磷酸化蛋白酶抑制剂(G2007)、BCA蛋白定量检测试剂盒(G2026)、5×蛋白上样缓冲液(G2013)、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒(G2003)、显影定影试剂(G2019)(武汉赛维尔生物科技);华鸿牌一次性采血针。

2 实验方法

2.1 实验孕鼠造模与分组

将68只(雌鼠50只，雄鼠18只)Wistar大鼠雌雄分笼于实验动物房中适应性养殖1周，将雌鼠与雄鼠按照1∶2的比例合笼喂养，自然交配受孕，采取托盘阴栓检查法筛选孕鼠，发现受孕后将受孕鼠单笼饲养，当日记为妊娠第1天，阴栓数多为1～4个，直径约3～5 mm，色乳白或淡红，将36只孕鼠随机分为模型组A1(少泽组)、A2(至阴组)、A3(少泽、至阴组)，模型对照组B(怀孕不针组)，每组9只；空白对照组C为不怀孕不针刺组9只；5只备用。

2.2 针刺方法

穴位定位参照文献大鼠标准穴位图谱[3]。穴位常规消毒，以一次性采血针于少泽、至阴穴点刺，使出血5滴，自孕1天起，每日1次，连续7天。模型A1组取穴少泽穴，模型A2组取穴至阴穴，模型A3组取穴少泽、至阴穴；模型对照组B与空白对照组C也进行抓取、固定，但不针刺，饲养7天。

2.3 观察指标与检测方法

2.3.1 血清泌乳素(PRL)测定 孕鼠妊娠第8天，将大鼠麻醉后，暴露腹腔，采腹腔静脉血5 mL后使用低速自动平衡微型离心机(DT5-3)离心(3 000 r/min)分离，-80℃保存，化学发光法测定PRL含量。

2.3.2 病理检测 将大鼠处死解剖后，取乳腺，立即固定，进行常规切片、HE染色，观察乳腺的形态学变化。

2.3.3 缝隙连接蛋白43(Cx-43)检测 在冰上取大鼠子宫(剥离胎儿及胎儿附属组织)，经液氮迅速冷冻后移至-80℃低温冰箱保存待测，按常规蛋白质印记法(Western Blot)检测子宫组织中缝隙连接蛋白43(Connexin 43,Cx-43)的表达，提取蛋白，进行蛋白浓度测定，按实验安排配制分离胶、浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀灌胶，加足够的电泳液后上样电泳。将样品加入电泳孔中电泳，浓缩胶电压75 V，分离胶用120 V，电泳至溴酚蓝刚跑出即可终止电泳，进行转膜。将ECLA和ECLB两种试剂在离心管中等体积混合，将PVDF膜的蛋白面朝上与此混合液充分接触，1～2 min 后，去尽残液，包好，放入暗匣中曝光，最后用显影、定影试剂进行显影和定影。将显色后的膜或底片照相，并用Lab Works软件对图像进行灰度分析。

2.4 统计学方法

3 实验结果

3.1 刺血不同穴位后血清PRL水平比较

空白对照组C不孕鼠的泌乳素水平最高，孕鼠模型组A各组及模型对照组B泌乳素水平均有不同程度下降；模型组A各组较模型对照组B泌乳素水平均有不同程度升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；模型A 组各组组间比较泌乳素水平差异无统计学意义(P>0.05)；各组泌乳素升高水平皆符合正常孕期的激素水平变化状态。表明妊娠期各组大鼠泌乳素水平较处女鼠均有不同程度降低，但不同穴位刺血(少泽穴、至阴穴、少泽至阴穴)均可促进妊娠大鼠泌乳素的分泌。详见表1。

表1 不同穴位刺激大鼠血清中PRL含量

注：与模型对照组比较，*P<0.05。

3.2 刺血不同穴位后乳腺形态学变化比较

空白对照组C大鼠乳腺小叶腺泡数少、大小不一，腺泡切面相对较小；模型组乳腺小叶腺泡数量增多，腺泡较为规则，腺泡切面相对较大，且模型A组各组较模型对照组B腺泡数量增多，腺泡更为规则；模型组A组组间无明显差异。表明妊娠大鼠的乳腺发育较处女鼠成熟，且不同穴位刺血均可促进乳腺小叶腺泡数量增长、成熟。详见图1。

图1 不同穴位刺激大鼠乳腺的形态学变化

3.3 刺血不同穴位后子宫组织Cx-43蛋白表达

模型A2组的Cx-43蛋白量及条带灰度值最高，模型A1组、A3组与模型对照组B的Cx-43蛋白表达相比均具有不同程度的升高(P<0.05)，空白对照组C最低。表明少泽穴、至阴穴对孕鼠子宫组织Cx-43蛋白的表达均具有相关性，且至阴穴的影响具有显著性。见表2、图2～3。

表2 不同穴位刺激大鼠子宫组织Cx-43蛋白表达灰度值

注：与模型对照组比较，*P<0.05。

图2 不同穴位刺激大鼠条带灰度值

图3 不同穴位刺激大鼠目的条带灰度值和内参条带灰度值比值

4 讨论

十二经脉的名称采用三阴三阳命名法，手、足经脉各有太阳、阳明、少阳、太阴、厥阴、少阴，正因此经脉之间的联络、手足同名经腧穴的配伍可有效提高临床疗效[4]。古代文献中有较多的少泽穴和至阴穴对孕产妇应用的文献记载，例如《针灸大成》云：“无乳，膻中、少泽此二穴神效。”《罗遗篇》中记载:“治横逆难产……如神,盖此至阴穴也”。两者所处部位相似，部位的形态也相似，功能皆指向女性孕产疾患，少泽和至阴之间可能存在功能交互影响，但在现代文献中未见关于少泽、至阴交互关系的研究。

本研究从泌乳素的水平及乳腺形态变化两方面证明了刺血少泽、至阴穴的显著影响及其相关性，首次在形态学视野下，遵循传统同名经配穴法找到了同名经、部位对称、形态相似、功效相近、疗效确切稳定的实验腧穴——少泽和至阴为研究对象，通过系统观察其对相关内分泌激素、组织形态等方面的影响差异，探讨同名经“同气相通”理论的现代医学依据，既遵守了同名经配穴法的中医学术思想，又因以部位形态学相似的腧穴为观察点则又符合现代医学重形体的思维方式，即将同名经、腧穴、腧穴功能(均指向女性内分泌激素)与腧穴部位结合在一起进行研究形成了中西并重的研究特色，提高经典理论的现代认同性，也能为临床提供一套稳定性和准确性高的配穴思路，并且能为进一步找到少泽、至阴局部与女性内分泌激素关联的关键因素，赋予传统腧穴以部位形态学等现代意义的研究打下理论和实践的基础。

1933年从动物垂体中分离提纯得到泌乳素(Prolactin，PRL)[5]，在哺乳动物，泌乳素可以促进乳腺发育、发动并维持泌乳[6-7]，PRL常被作为反映乳汁分泌的敏感指标之一。在妊娠期，雌激素、孕激素会抑制泌乳素，但分娩后，雌激素、孕激素降低，泌乳素促进泌乳[8]，江青东[9]通过实验测得大鼠PRL的含量在处女期、妊娠前期、妊娠、分娩后呈现“N”形分泌的规律，符合生理学的研究。哺乳动物的乳腺发育随着其受精、妊娠、产仔、哺乳和断奶的过程, 可重复经历妊娠期、泌乳期和退化期[10]。乳腺组织形态变化可有效反映不同穴位刺激的有效性和相关性。缝隙连接蛋白43(CX43)是细胞缝隙连接的主要蛋白，参与细胞增殖、分化及胚胎发育过程的调节，对子宫组织的表达具有特异性[11]。研究表明，Cx43可促进小鼠子宫基质细胞发生蜕膜化，而子宫内膜蜕膜化是胚泡植入、胎盘形成以及妊娠维持的必备条件之一[12]。本研究从上述指标观察刺血少泽、至阴穴对孕鼠的不同影响，探究同名经“同气相通”理论的现代医学依据。

古人为寻求对人体的把握而采取将研究对象按照一定方式进行归类，在处理类与类之间关系时，实现对事物更深刻的认识和运用[13]，故在传统医学当中常有虽为相同的医学名词，但由于所要认识的对象不同而采取的分类方式也就不同，该医学名词的内涵也就随之不同的情况，比如“三焦”“四关”[14-17]，这也包括对经络和腧穴的处理。脏腑官窍之间的功能关联与其之间的形态学上的相似性有关，即“窍法藏”，比如“口”的形态与“脾”的形态相似[16]，这为沟通重“神气”的传统医学与重“形体”的现代医学提供了桥梁，同名经即存在着所处部位以及所处部位的形态学上的这类关联。本实验结果为“同气相通”理论的科学实在性提供了突破口，陈晓楠[18]等通过文献与临床研究加以佐证。

同时本实验尚有不足，如模型孕鼠因处于怀孕的特殊时期，实验时每日抓取可引起孕鼠的情绪不稳，且剧烈运动、创伤、手术等均能增加泌乳素的分泌[19]。这些模型制造中的干扰因素需要进一步解决。