基于网络药理学研究红根草化学成分的分子机制△

胡俊辉，姚银辉，王莹，赵静怡，姜艳平*

1.承德医学院附属医院，河北 承德 067000；2.承德医学院，河北 承德 067000

红根草Salviaprionitis又称作“草原老鹳草”，主要分布于广东、广西、江西、湖南、浙江等省，民间常用全草入药用于治疗急性扁桃体炎、肺炎、肠炎腹泻、腹痛、痢疾，并且曾报道红根草邻醌对P388白血病有很强的抑制作用[1]。随着对红根草化学成分及药理作用的深入研究，现已有黄酮类、二萜类、生物碱等多种成分报道[2-3]。但是对红根草单体化合物的药理作用和其相应机制研究较少，限制了其化学成分药物开发的利用。

中药综合数据库(Traditional Chinese Medicine Integrated Database，TCMID)收集中药各方面的信息数据，包括方剂组成、草药、中药成分、药物作用靶点和疾病等。TCMID提供全面中药数据信息，不仅有利于促进中药现代化研究，也便于开发潜在的新药和揭示其作用机制[4-5]。本文基于网络药理学方法，研究红根草化学成分的分子机制，探讨红根草多成分、多靶点的药物作用机制，进一步深入研究红根草的药用价值。

1 材料与方法

1.1 数据挖掘

在中药综合数据库(http：//www.megabio-net.org/tcmid/)中，以“HONG GEN CAO”为检索词，对红根草的中药化学成分进行收集，建立其化学成分、潜在作用靶点、疾病的分析数据集。并且对潜在作用靶点的基因名通过UniProtKB(http：//www.uniprot.org)进行提取，对象限定为人类(Homosapiens)。

1.2 功能富集分析和蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络构建

首先对红根草化学成分的潜在作用靶点的基因输入STRING(Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins，http：//sting-db.org)构建相互作用蛋白网络，对相互作用蛋白网络构建以分值(median confidence)>0.4的蛋白网络数据导入软件Cytoscape 3.5.1进行可视化。关键基因的选择采用该MCODS(Molecular Complex Detection)v1.4.2插件进行分析。功能富集分析采用插件BiNGO进行生物过程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)、细胞组分(cellular component，CC)的可视化，设定P<0.05。

1.3 通路富集分析

在KOBAS 3.0(http：//kobas.cbi.pku.edu.cn/index.php)中输入红根草化学成分的潜在作用靶点的Uniprot，对象限定为人类(Homosapiens)，进行京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析，设定P<0.05选择通路，采用Cytoscape 3.5.1构建可视化红根草-化学成分-潜在作用靶点-KEGG通路图。

2 结果

2.1 红根草化学成分

本次收集红根草化学成分共18种(表1所示)。其中4种化学成分有对应的潜在作用靶点(201个)和疾病(204种)，如图1所示，4种化学成分有对应的潜在作用靶点的异同，它们分别是3，4-dihydroxybenzoicacid(原儿茶酸)、4-hydroxysaprorthoquinone(4-羟基红根草邻醌)、dihydrotanshinone Ⅰ(二氢丹参酮Ⅰ)和tanshinone Ⅰ(丹参酮Ⅰ)。通过上述数据利用Cytoscape软件构建出红根草-化学成分-潜在作用靶点-疾病网络图，其结果共410个节点、413条边。红根草化学成分丹参酮Ⅰ的靶向蛋白最多，并且多种疾病对应同种靶向蛋白。

表1 红根草18种化学成分

注：3，4-dihydroxybenzoicacid(原儿茶酸)、4-hydroxysaprorthoquinone(4-羟基红根草邻醌)、dihydrotanshinone Ⅰ(二氢丹参酮Ⅰ)和tanshinone Ⅰ(丹参酮Ⅰ)分别用粉色、草绿色、黄色和蓝紫色表示。图1 红根草4种化学成分对应的潜在作用靶点

2.2 红根草化学成分潜在作用靶点的PPI网络构建

通过STING构建红根草潜在作用靶点的相互作用网络图，利用Cytoscape软件获得其网络关系可视化。构建相互作用蛋白的网络分值(median confidence)，>0.4的蛋白才可纳入，所以原201个蛋白去除了45个，从而得到156节点、536条边的网络相互作用图。并采用该插件MCODSv1.4.2进行分析，获得红根草化学成分潜在作用靶点的关键基因网络关系，如图2所示。

注：黄色为作用靶点。图2 红根草潜在作用靶点的相互作用中关键节点

2.3 红根草化学成分潜在作用靶点的功能富集分析

通过Cytoscape软件的插件BiNGO功能富集分析生物学过程(BP)、分子功能(MF)和细胞组分(CC)，如图3所示，其中共697个节点、1096条边，图中P<0.05呈黄色显示。其中BP包括metabolic process、proteolysis和regulation of biological quality等；MF包括scavenger receptor activity、catalytic activity和serine hydrolase activity等；CC包括extracellular region、extracellular region part和extracellular space等。

图3 红根草潜在作用靶点功能富集分析

2.4 KEGG通路富集分析

通过KOBAS 3.0分析得到KEGG通路共196个，其中P<0.05的通路111个，包括作用蛋白共109个，红根草化学成分的相关通路信息按照P值由小到大排序列出前10个(见表2)。通过上述获得的18个关键基因在KOBAS 3.0分析得到KEGG通路共107个，其中P<0.05的通路87个，按照P值由小到大排序列出前10个(见表3)。其中两次KEGG分析中共同有的67个通路，其中排前10个共同有的通路有7个，而关键基因只有12个存在于信号通路中，具体可见表2和表3。将上述通路信息与红根草、化学成分和潜在作用靶点结合，采用Cytoscape 3.5.1构建可视化红根草-化学成分-潜在作用靶点-KEGG通路的网络关系(见图4)和红根草-化学成分-关键靶点-KEGG通路的网络关系(见图5)。

表2 红根草化学成分的相关通路信息(前10个通路)

表3 红根草关键基因的相关通路信息(前10个通路)

注：绿色为中药，蓝色为化学成分，黄色为作用靶点，红色为KEGG通路。图4 红根草-化学成分-潜在作用靶点-KEGG通路的网络关系

注：绿色为中药，蓝色为化学成分，黄色为作用靶点，红色为KEGG通路。图5 红根草-化学成分-关键靶点-KEGG通路的网络关系

3 讨论

网络药理学作为一种有助于提高发现药物作用机制的方法，在心血管药理[6]、肿瘤药理[7]和抗病毒感染[8]等多方面都有应用。本研究通过TCMID挖掘红根草的化学成分、潜在作用靶点和疾病，结合STING、KOBAS和Cytoscape分析蛋白相互作用、KEGG通路和GO功能富集分析，获得4种化学成分，201个潜在作用靶点，204种疾病，67个信号通路，体现了红根草作为中药具有多成分、多靶点、协同作用的特点。通过关键基因的KEGG通路分析，进一步说明红根草化学成分和肿瘤的有关通路密切相关。

KEGG通路富集分析中与感染相关的通路包括Staphylococcusaureusinfection、Epithelial cell signaling inHelicobacterpyloriinfection和HTLV-I infection。这与早先报道红根草黄酮类具有体外抑菌的作用结果一致[9]。因此关于红根草对肠炎腹泻、腹痛和痢疾的疗效研究可与上述的通路联系，进一步为临床治疗提供理论依据。

曾有研究报红根草邻醌对P388白血病有很强的抑制作用[1]，但是对于其作用机制了解甚少。本研究中KEGG通路富集分析中包括Chronic myeloid leukemia，这就为红根草研究白血病提供研究理论基础，便于后续实验对此机制加以证明。同时KEGG通路富集分析中包括多条和肿瘤相关的通路，如Transcriptional misregulation in cancer、Colorectal cancer、Pathways in cancer、Bladder cancer和MicroRNAs in cancer等通路。在1995年，我国学者就报道了对红根草邻醌结构修饰得到新化合物(沙尔威辛)，表现具有很强的抗肿瘤活性。其药理实验证实沙尔威辛不仅可以抑制癌细胞的生长，还可阻断癌细胞修复再生，与同类药物相比，具有不良反应小、抗耐药、抗转移的特性[2]。因此为研究红根草抗肿瘤活性提供理论依据，丰富其抗肿瘤方面的药用价值。

4 结论

本研究对于红根草化学成分的网络药理学只限于4种化学成分，其中以丹参酮Ⅰ为主。随着红根草化学成分研究的深入，不仅仅局限于18种已知成分，越来越多的有关成分研究将随之报道。对于红根草化学成分的药理作用机制研究亦加快进度，才可极大扩展对其相关机制的认识和了解，为红根草药用植物资源的开发利用提供依据。