HPLC-MS/MS同时测定鲜铁皮石斛中141种农药及代谢物残留△

王鹏思，吴佩玲，薛健

中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193

铁皮石斛为兰科植物铁皮石斛DendrobiumofficinaleKimura et Migo的干燥茎。11月至翌年3月采收，可加工成“铁皮枫斗(耳环石斛)”和“铁皮石斛”[1]。现代研究表明铁皮石斛主要含有芪类、酚类、多糖、氨基酸、木质素类等成分，具有增强免疫、降血糖、抗肿瘤等药理作用[2-3]。铁皮石斛野生资源已濒临枯竭，但“救命仙草、药界大熊猫”铁皮石斛的需求量却越来越大，因此我国一些科研机构和种植公司为满足这种需求，经过近20年的研究和探索，实现了铁皮石斛种苗繁育和人工栽培技术的突破性进展。目前铁皮石斛主要是通过人工种植的方式进行生产，在此过程中极易发生病虫害，药农难免会使化学农药进行防治[4-6]。但由于药农缺乏病虫害防治相关基础知识和常识，常常是依照农药经销商的推荐意见购买和使用农药，导致农药乱用滥用现象普遍，严重威胁药材的质量和产区生态安全[7]。

目前，关于铁皮石斛中的农药残留多采用气相色谱-电子捕获检测器(GC-ECD)[8-9]、气相色谱-火焰光度检测器(GC-FPD)[10]、气相色谱-质谱法(GC-MS)[11]、气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)[12-13]等，液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[14]虽有报道，但仅测定了8种有机磷农药，总体测定农药品种偏少，难以较全面地了解铁皮石斛中的农药残留状况，从而无法对铁皮石斛中的残留农药进行较全面的风险评估。

鲜铁皮石斛未经加工、炮制，作为药食同源物质，采收后可直接鲜食，且易于人体吸收，价格较低，适合大众消费。因此，本研究以鲜铁皮石斛为研究基质，建立了鲜铁皮石斛中141种农药及代谢物的HPLC-MS/MS检测方法，从而为更加真实、全面地了解铁皮石斛中的农药残留状况提供一种简便快捷、经济节约、稳定耐用的多残留分析方法，该方法也可为相关部门对鲜铁皮石斛药材的安全监测提供重要参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

岛津LC-20A高效液相色谱串联AB SCIEX 5500 QTRAP质谱仪(配电喷雾离子源ESI源)；Milli-Q超纯水机(美国Millipore公司)；PL203型电子天平(瑞士梅特勒)；VORTEX-5旋涡混合器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；TDZ5-WS低速离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；LABOROTA4000/4型旋转蒸发器(德国海道夫)。

1.2 试剂与材料

乙腈(HPLC级，美国Fisher公司)；乙腈、冰醋酸(HAc)(分析纯，北京化工厂)；甲酸(LC-MS级，上海安谱实验科技股份有限公司)；无水硫酸镁、无水乙酸钠(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；超纯水；141种农药及其代谢物(100 mg·L-1)均购自中国农业部环境保护科研监测所；空白鲜铁皮石斛样品经中国医学科学院药用植物研究所张本刚研究员鉴定为为兰科植物铁皮石斛DendrobiumofficinaleKimura et Migo的新鲜茎。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

2.1.1 混合储备液 分别准确吸取适量单一对照品溶液(100 mg·L-1)，用色谱乙腈稀释，制成各农药组分质量浓度均为500 ng·mL-1的混合储备液，保存于-18 ℃冰箱中。

2.1.2 基质匹配对照品溶液 按照2.2项下样品前处理步骤制备不含目标化合物的空白基质溶液，准确吸取适量混合储备液，用基质溶液作为稀释溶剂制成质量浓度分别为1、2、5、10、20、40、60、80、100 ng·mL-1的基质匹配对照品溶液。

2.2 样品前处理

取供试品，粉碎成浆状，取约5 g，精密称定，置50 mL具塞离心管中，准确加入10 mL 1%乙酸乙腈，涡旋3 min，加入1 g无水乙酸钠，涡旋混匀，再加入1 g 无水硫酸镁，立即摇散，并涡旋1 min，离心(4000 r·min-1)5 min，精密吸取上清液1 mL，用微孔滤膜(0.22 μm)滤过，即得。

2.3 分析条件

2.3.1 色谱条件 C18色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.9 μm)；流速：0.2 mL·min-1；柱温：30 ℃；进样量：2 μL；流动相A：色谱乙腈，流动相B：0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱程序为：0～0.5 min，70%～70%B；0.5～9 min，70%～10%B；9～13 min，10%～10%B；13～13.1 min，10%～70%B；13.1～18 min，70%～70%B。分析时间：18 min。

2.3.2 质谱条件 以三重四级杆串联质谱仪检测，电喷雾(ESI)离子源，监测模式为多反应监测(MRM)；扫描方式：正离子(131个化合物)和负离子(10个化合物)同时扫描，离子喷雾电压(IS)+5.5 kV；离子喷雾电压(IS)-4.5 kV；离子源温度550 ℃，雾化气(GS1)：50 psi(1 psi≈6.895 kPa)，辅助气(GS2)：50 psi，气帘气(CUR)：35 psi，各化合物参考保留时间、监测离子对、去簇电压(DP)、碰撞电压(CE)见表1。

表1 141种农药及代谢物的保留时间、质谱参数

续表1

续表1

2.4 方法学验证

2.4.1 方法的线性和灵敏度 将2.1.2项下配制的基质匹配对照品溶液在2.3项下分析条件下进样，以各农药的质量浓度X为横坐标，以各农药的定量离子对应的峰面积Y为纵坐标绘制校正曲线。结果显示，141种农药在各自的线性范围内呈现良好的线性关系，r均≥0.995 0(见表2)。本研究通过向空白铁皮石斛样品中添加不同量的农药混合对照品溶液以制备多个较低水平(1、2、5、10 μg·kg-1)的加标样品，按照2.2项下样品前处理制备供试品溶液并在2.3项下分析条件下进行测定，以信噪比(S/N)大于或等于10时的最低添加水平为该农药的定量限(LOQ)。结果(见表2)可知，各化合物的定量限均在1～10 μg·kg-1。

表2 141种农药及代谢物方法学验证数据

续表2

2.4.2 方法的回收率和精密度 准确称取空白铁皮石斛样品5.0 g于50 mL具塞离心管中，分别添加适量的500 μg·L-1的混合储备液，制备10、20、50 μg·kg-13个浓度水平(每个水平重复3次)的添加样品，放置30 min以上，按照正文2.2项下中“准确加入1%乙酸乙腈10 mL”开始至样品前处理完成。为减小基质效应的影响，同时制备空白铁皮石斛基质溶液，并配制10、20、50 μg·L-1的基质混合对照品溶液作为计算回收率的对照溶液。由表2知，除灭蝇胺、吡蚜酮、甲基硫菌灵、联苯肼酯外，其余137种农药及代谢物的回收率均在60.0%～120.0%，RSD均<20%，n=3。

《GB/T 27417-2017 合格评定 化学分析方法确认和验证指南》中指出添加质量浓度水平<0.1 mg·kg-1时，回收率在60.0%～120.0%即可，王京辉等[15]指出多残留分析(一次需要分析数十、甚至上百种农药)中60%～140%的回收率范围是可以被接受的。因此，本研究所建立的方法符合农药多残留分析的要求。

3 讨论

3.1 农药品种的选择

本研究依据以下原则，遴选出了目前对于中药材铁皮石斛具有监测意义并且适于HPLC-MS/MS检测的141种农药品种。这些原则是：1)中华人民共和国农业部第194、199、274号等公告中明令禁止或限制在中药材种植中使用的农药(http：//www.foodmate.net/law/dongtai/177625.html)，如涕灭威、杀扑磷、甲磺隆等；2)通过文献调研[4-6]和实地调研等方式，针对性地选取防治铁皮石斛病虫害的常用农药品种，如多菌灵、吡虫啉、苯醚甲环唑等；3)部分有毒理学意义的农药代谢物，如3-羟基克百威、特丁硫磷亚砜等；4)参考《美国药典》《欧洲药典》等规定的植物药中有关农药残留检测品种，如二嗪磷等。

3.2 前处理条件的确定

3.2.1提取溶剂的选择 丙酮、乙酸乙酯和乙腈是样品中多农药残留分析的常用提取溶剂。其中，丙酮易提取样品中的色素等杂质，且丙酮与水互溶，难以与水相分层。乙酸乙酯极性小，用其进行提取时大部分极性农药难以转移到有机相中，且易提取基质中的蜡质、脂肪等非极性杂质[16-17]。丙酮和乙酸乙酯还均易挥发，有刺激性气味，对人体健康危害较大。而乙腈作为提取溶剂时，可萃取较宽范围极性的多农药残留，且可避免基质中的蜡质、脂肪等亲脂杂质的干扰。《中华人民共和国药典》《中华人民共和国国家标准》《AOAC Official Method》(2007.01)《BS EN 15662：2008》等公认的多农药残留测定法中也均选用乙腈作为提取溶剂，因此本研究选用乙腈作为提取溶剂。此外，本研究涉及农药包括有机磷类、氨基甲酸脂类、磺酰脲类等多种类别的农药，多数农药在偏酸性条件下较稳定，在碱性条件下易分解。因此，在乙腈中加1%乙酸，与盐析时加入的乙酸钠构成缓冲体系，可增强酸碱敏感性农药在乙腈提取液中的稳定性[18]。

3.2.2 净化与否的确定 分散固相萃取法(d-SPE)是QuEChERS法中采用的净化方法。分散固相萃取法使用较多的净化剂材料有PSA、C18、GCB等。但经过前期研究和文献[19-20]发现PSA类吸附剂对甲磺隆、氯磺隆、胺苯磺隆等含羧基农药的吸附性较强以致此类农药难以回收。而GCB也会导致片状结构农药的回收率降低[21]。因此采用2.2项下不净化的前处理方法进行了鲜铁皮石斛20 μg·kg-1的添加回收实验(n=3)，结果表明20 μg·kg-1添加水平下不净化即可满足大多数(138个)农药回收率在60%～120%，且方法灵敏度高，更具有操作简便、快速、经济节约等优点，因此确定的样品前处理方法为无需净化的方法。

另外，本研究为降低基质效应的影响，采用了空白样品基质提取液来稀释农药对照品溶液，测定时可使样品溶液和对照品溶液的离子化条件更加接近，从而确保分析结果的准确可靠。

4 结论

本研究建立了铁皮石斛药材中141种农药及其代谢物残留快速检测的HPLC-MS/MS方法，经验证该方法操作简便、灵敏度高、选择性好，为铁皮石斛药材中多类别农药残留的例行检测、风险评估等研究提供了一种高效、可靠的分析手段。