UPLC法和HPLC法对比检测乳酸菌发酵液中的γ-氨基丁酸

郭海阳，谭海生，陈丽伟，宋 贝，杨劲松*

（1.海南大学 食品科学与工程学院，海南 海口 570228；2.海南大学 材料科学与工程学院，海南 海口 570228）

γ-氨基丁酸（γ-aminiobutyric acid，GABA）是一种天然非蛋白质组成成分的氨基酸，广泛存在于动物、植物和微生物中[1]。GABA具有降低血压、治疗癫痫、改善脑细胞、增强记忆和促进睡眠等多种生理功能[2-4]，它不仅在哺乳动物中枢神经系统中充当重要的抑制性神经递质，还参与多种生命代谢活动，对生物体正常的生命活动起着重要的调节作用，在非神经的组织中发挥激素或营养因子的作用[5-6]。在微生物体内，GABA的合成原理是以L-谷氨酸（L-glutamic，L-Glu）为底物，谷氨酸脱羧酶（glutamate decarboxylase，GAD）为催化酶制剂将L-Glu或L-谷氨酸单钠盐（L-glutamic acid monosodium salt，L-MSG）脱羧获得[7-8]。2009年，由生物法制备的GABA被批准为“新资源食品”，目前GABA作为一种新型的功能性因子，在食品及医药领域都具有良好的应用前景[9-10]。

为了更方便、快捷的检测GABA含量，建立适应复杂转化液中定量分析GABA的方法是微生物法制备GABA的前提条件。由于GABA本身对紫外光吸收小，一般需要衍生化后才能使用紫外检测器检测[11]。目前常用的衍生试剂有苯二醛-2-巯基乙醇、丹磺酰氯以及邻苯二甲醛（O-phthalaldehyde，OPA）等[12-15]，其中OPA是最为常用的一般实验选用的衍生试剂，具有衍生时间短、价格便宜、简单易操作等优点。目前GABA定量分析方法主要有高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法、电泳法和纸层析法等[16-19]，其中高效液相色谱法应用最为广泛。然而，由于GABA需要衍生化后才能检测，加上出峰时间较长，目前面对大批量样品时仍无法快速检测。超高效液相色谱（ultra performance liquid chromatography，UPLC）与传统的HPLC相比，UPLC的速度、灵敏度及分离度均优于HPLC。目前，UPLC多应用于代谢组学分析及其他一些生化领域，在天然产物的分析方面运用也逐渐兴起，因为在这些领域深入研究需要更高的分析精度。目前，利用UPLC法与HPLC法测定微生物制备液中GABA含量的研究鲜有报道，本试验采用邻苯二甲醛（OPA）柱前衍生-紫外检测UPLC法与HPLC法进行方法学验证和对比研究，旨在寻求一种快速准确测定乳酸菌发酵液中GABA含量的方法，以期为大通量筛选产GABA的乳酸菌提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株

乳酸菌：本研究室保存的乳酸菌菌种。

1.1.2 化学试剂

γ-氨基丁酸标品（纯度＞99.9%）：上海源叶生物科技有限公司；谷氨酸钠（纯度＞98.0%）：生工生物工程股份有限公司；甲醇（色谱纯）：国药集团化学试剂有限公司；正丁醇、茚三酮、丁二酸钠、硼酸、无水乙酸钠（均为分析纯）：广州化学试剂厂；冰醋酸（分析纯）：上海陆都化学试剂厂；β-巯基乙醇、邻苯二甲醛：酷尔化学科技有限公司。

1.1.3 培养基

MRS培养基（固体培养基中加2%琼脂）：蛋白胨1%、牛肉膏1%、酵母提取物0.5%、柠檬酸胺0.2%、葡萄糖2.0%、吐温-80 0.1%、乙酸钠0.5%、磷酸氢二钾0.2%、硫酸镁0.058%、硫酸锰0.025%、调pH值为6.2～6.6。121 ℃条件下灭菌20 min，用于菌种的培养。

TYG液体培养基：胰蛋白胨0.5%、酵母提取物0.5%、葡萄糖1.0%、丁二酸钠0.5%，调pH值为6.5。121 ℃条件下灭菌20 min，用于发酵培养。

1.2 仪器与设备

岛津LC-2030高效液相色谱仪、UV-1800紫外可见分光光度计：日本岛津仪器有限公司；ACQUITY UPLC I-Class超高效液相色谱：美国Waters公司；Millipore纯水仪：默克密理博（中国）有限公司；5417R离心机：德国Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

种子培养液制备：从MRS平板上挑取适量经纯化后的乳酸菌菌株，接种到种子培养基（MRS液体培养基中）中，37 ℃条件下静置培养16 h。

发酵培养液制备：按体积分数3%的接种量取上述种子培养液接入到添加了1%谷氨酸的TYG液体培养基中，37 ℃条件下静置培养24 h，备用。

1.3.2 HPLC操作条件

参考李鹏等[20]的测量方法。衍生处理：取200 μL乳酸菌发酵液或GABA标准品溶液于5 mL的EP管中，加入600 μL的OPA衍生剂，混匀，然后再加入800 μL磷酸二氢钾缓冲液，避光反应1 min，经0.22 μm过滤膜过滤后立刻进样，整个衍生过程控制在3 min内。

HPLC条件：Luna-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速0.8 mL/min；柱温27 ℃；进样量10 μL；检测波长333 nm；流动相为醋酸-醋酸钠缓冲液∶甲醇=55∶45，V/V。

1.3.3 UPLC操作条件

衍生处理同1.3.2。

UPLC条件：Acquity UPLC Waters BEH C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流速0.8 mL/min；柱温27 ℃；进样量10 μL；检测波长333 nm；流动相为醋酸-醋酸钠缓冲液∶甲醇=55∶45，V/V。

2 结果与分析

2.1 检测波长的选择

分别吸取400 μg/mL和1 000 μg/mL的γ-氨基丁酸标准准溶液各200 μL，分别按1.3.3中的衍生处理对GABA标准溶液进行衍生，取衍生后的反应液进行全波长扫描（200～800 nm），扫描结果见图1。

图1 γ-氨基丁酸标准品全波长扫描结果Fig.1 Full-wavelength scanning results of γ-aminobutyric acid standard

由图1可知，220～278 nm干扰峰过多，峰值接近，无法明确区分，且不随γ-氨基丁酸标准溶液浓度的变化而改变，主要是由于样品中衍生剂的影响而导致的。γ-氨基丁酸标准溶液的最大吸收峰在波长310～370 nm处，且吸收峰区分明显，周围无干扰，最大吸收波长为333 nm。因此，进行UPLC和HPLC分析时以333 nm作为检测波长。

2.2 GABA标准品的HPLC法和UPLC法测定

GABA标准品HPLC法和UPLC法分析结果见图2。由图2A可知，在1.3.3色谱条件下，标准液在高柱效Acquity UPLC Waters BEH C18色谱柱上得到了良好的洗脱和分离，GABA在柱上的保留时间是0.837 min。由图2B可知，在1.3.2色谱条件下，标准液在Luna-C18色谱柱上得到了良好的洗脱和分离，GABA在柱上的保留时间是23.034 min。与HPLC法比，UPLC法的出峰时间明显缩短，检测效率有了显著的提高，并且其他杂质对测定没有干扰，HPLC法和UPLC法都能很好的对GABA进行分离。

图2 γ-氨基丁酸标准品分析UPLC（A）和HPLC（B）色谱图Fig.2 Chromatogram of γ-aminobutyric standard by UPLC (A) and HPLC (B)

2.3 反应时间对衍生反应的影响

吸取200 μLγ-氨基丁酸标准准溶液，按1.3.2方法进行衍生，再分别放置0、1 min、2 min、3 min、4 min、5 min、6 min后采用UPLC法检测，考察不同放置时间对GABA峰面积的影响，并作色谱图和峰面积的变化曲线，结果见图3。由图3可知，γ-氨基丁酸标准溶液经过柱前衍生反应后，其响应值（峰面积）会随着放置时间的增加而明显减小。6 min内峰面积从8 900 216下降至4 561 646，可见γ-氨基丁酸衍生物极其不稳定，其衍生产物会随着衍生时间的延长而逐渐分解，因此衍生时间对试验结果有显著地影响，应该严格控制衍生时间相同，以确保得到最大响应值的同时降低误差，保证试验具有好的准确性和重现性，本试验将整个衍生反应过程控制在3 min。

2.4 γ-氨基丁酸标准曲线

将配制1000.0μg/mL的GABA标准品溶液稀释成质量浓度为100.0 μg/mL、200.0 μg/mL、400.0 μg/mL、600.0 μg/mL、800.0 μg/mL的标准工作液，衍生后进样。以峰面积（y）为纵坐标，标准液质量浓度（x）为横坐标绘制标准曲线，得到标准曲线回归方程及相关系数见表1。由表1可知，HPLC法和UPLC法在GABA质量浓度为100.0～1 000.0 mg/mL范围内线性关系良好（相关系数R2均＞0.998）。

表1 γ-氨基丁酸标准曲线回归方程Table 1 Regression equation of standard curve of γ-aminobutyric acid

2.5 精密度试验

配制质量浓度为800 μg/mL的γ-氨基丁酸标准溶液，采用UPLC和HPLC两种方法对γ-氨基丁酸标准品和香蕉上初筛到的乳酸菌发酵液进行定量检测，每个样品在不同时间段各重复测量5次，并根据γ-氨基丁酸标准曲线计算样品中的GABA含量，结果见表2。由表2可知，HPLC法的平均相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为1.175%，UPLC法RSD为0.529%，2种检测方法的日内精密度与日间精密度的RSD均＜1.5%，表明这2种方法均具有良好的精密度，并且UPLC法测量的结果更为精确。

表2 γ-氨基丁酸检测精密度试验结果Table 2 Results of precision tests of γ-aminobutyric acid determination

分别吸取不同编号乳酸菌发酵液各100 μL，再分别加入400.0 μg/mL的γ-氨基丁酸标准液100 μL。按1.3.3方法进行衍生，再采用UPLC法和HPLC法两种方法测量GABA含量，计算回收率，结果见表3。

表3 γ-氨基丁酸检测加标回收率试验结果Table 3 Results of standard recovery rate tests of γ-aminobutyric determination

由表3可知，UPLC法和HPLC法的平均回收率在98.28%～99.36%，超高效液相色谱法的RSD（0.680%）低于高效液相色谱的RSD（1.053%），说明UPLC法测量GABA时准确度更高。

2.6 乳酸菌发酵液中γ-氨基丁酸含量测定结果

取离心后的不同乳酸菌发酵液各200 μL，经OPA柱前衍生后，采用UPLC法分别测定各发酵液样品，每个发酵液测定5次，得到γ-氨基丁酸的峰面积。根据标准工作曲线的回归方程计算，得到样品中γ-氨基丁酸的含量，结果见表4。

表4 乳酸菌发酵液中γ-氨基丁酸含量测定结果Table 4 Determination results of γ-aminobutyric acid contents in lactic acid bacteria fermentation broth

由表4可知，通过UPLC法对5株产GABA的乳酸菌发酵液进行定量分析，最后筛出产γ-氨基丁酸最高的菌株编号为CT4-1，其γ-氨基丁酸的产量为928.095 μg/mL。

3 结论

本实验对超高效液相色谱（UPLC）与高效液相色谱（HPLC）两种方法进行对比研究，采用邻苯二甲醛（OPA）柱前衍生-紫外测定乳酸菌发酵液中的γ-氨基丁酸（GABA）含量。试验结果表明，GABA经UPLC法与HPLC法2种方法测定的含量在所需质量浓度范围内均具有良好的线性关系（R2＞0.998）。UPLC法的平均相对标准差为0.529%，平均回收率为99.59%；HPLC法的平均相对标准差为1.175%，平均回收率为98.06%。精密度和回收率试验表明，2种检测方法均可准确定量分析乳酸菌发酵液中GABA含量。2种方法相比较，UPLC法的操作更为简单、出峰时间短，色谱峰具有较好的分离度，测定结果准确，精密度好，灵敏度高，能够满足检测大批量乳酸菌发酵液中的γ-氨基丁酸含量。