响应面法优化芒果蜂蜜果酒发酵工艺的研究

尚远宏，田金凤

（攀枝花学院 生物与化学工程学院，四川 攀枝花 617000）

果酒是以水果为原料，经过微生物发酵等多道工序调配而成的含有水果风味和一定酒精度的饮品，基本保留水果营养成分，易于人体吸收[1]。经常饮用果酒能够改善心脑血管功能，促进机体新陈代谢及血液循环，预防脑血管、动脉硬化和高血压等疾病[2-3]。

芒果（Mangifera indica）为漆树科芒果属的多年生植物[4]，其果实素有热带果王之称[5-8]。凯特芒果种植占攀枝花市芒果种植总面积的70%[9]，其果实含有大量的维生素、有机酸、蛋白质、糖类等对人体有益的营养成分。然而，由于种植面积的扩大和产量的增长，加之芒果自身不易保藏，有明显的季节性特征[10]，产后损失严重，出现鲜果供过于求的现象，影响果农增收[11]。野拔子（Elsholtzia rugulosaHemsl.）蜂蜜被称为“金牌蜜”，属于天然营养佳品，受到了很多人的青睐，为蜜中上品[12]，分布于云贵川，花期在10月下旬至12月上旬，主要开花流蜜期30～40 d[13]。野拔子蜂蜜营养丰富，含有氨基酸、蛋白质、花粉、维生素、微量元素等多种活性物质，食用价值高[12]。同时，蜂蜜在果酒中可替代白砂糖的碳源补充、调节糖度和减少褐变反应。因此，研制的果酒结合芒果独特的风味特性和野拔子蜂蜜较高的食疗价值的特点，能解决攀枝花芒果的销售问题，发展前景广阔。

芒果发酵酒的研究报道众多[14-18]，但是芒果蜂蜜果酒的研发却鲜有报道。本研究充分利用攀枝花本地芒果和野拔子资源丰富的优势，以凯特芒果和野拔子蜂蜜作为原料制备芒果蜂蜜果酒。采用单因素及响应面试验研究凯特芒果野拔子蜂蜜果酒发酵工艺，以期得到既美味可口又营养丰富的果酒，满足人们对食品要求提高的消费观念。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

果胶酶（酶活10 000 U/g）：山东西亚化学工业有限公司；柠檬酸（食品级）：潍坊英轩实业有限公司；安琪专用葡萄酒酵母：安琪酵母股份有限公司；凯特芒果：市售；野拔子蜂蜜：百草岭蜂业责任有限公司；其他试剂为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

BDV-325414167电子天平：捷久计量衡器（上海）有限公司；PHS-550数显酸度计：杭州陆恒生物科技有限公司；A115038糖度计：上海邦西仪器科技有限公司；0.1分度酒精计：武强县精创仪器仪表厂；ZTS-1P烘箱：昆山台顺测试科技有限公司；LRH-250-2振荡培养箱：广东省医疗器械厂；ZDHW数显恒温水浴锅：北京中兴伟业仪器有限公司；PHX智能生化恒温培养箱：宁波莱福科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 芒果蜂蜜果酒的加工工艺流程及操作要点

原料预处理：选用无腐烂、病虫害的成熟度好的芒果，清洗，沥干后去皮去核。

打浆出汁：去皮去核后的芒果榨汁，添加果胶酶（4 g/L）和纤维素酶（0.4 g/L），40 ℃酶解90 min，90 ℃灭酶3 min[11]，冷却至室温，过滤后得到原汁。

调整成分：用适量野拔子蜂蜜调整初始糖度为20%，用柠檬酸调整pH值为3.6，加入50 mg/L偏重亚硫酸钾以杀菌并提高稳定性，使果酒醇正香浓[19]。

酵母活化：将安琪酵母加入10%（V/V）的野拔子蜂蜜溶液中，混合均匀，置于35 ℃的恒温水浴活化60 min，待观察其产气泡丰富时，即可作为菌种使用。

发酵：果汁在无菌条件下，接种活化后的0.10%酵母菌，然后在24 ℃恒温培养箱中发酵10 d。

过滤澄清：虹吸上层酒液至无菌玻璃容器中，于冰箱冷藏澄清1 d，过滤，得到澄清有光泽的果酒。

调配：在发酵过程中产生了酸，为使酸度适当降低，澄清处理过的芒果蜂蜜果酒可用酒石酸钾钠（或碳酸钠）适当的调节[11]，65 ℃巴氏杀菌30 min[20]，得到酒味协调，风味更加突出的果酒。

1.3.2 芒果蜂蜜果酒发酵工艺优化单因素试验

分别调整酵母添加量（0.04%、0.06%、0.08%、0.10%、0.12%）、发酵温度（20 ℃、22 ℃、24 ℃、26 ℃、28 ℃）、初始pH值（3.2、3.4、3.6、3.8、4.0）、发酵时间（6 d、8 d、10 d、12 d、14 d）、初始糖度（16%、18%、20%、22%、24%），按1.3.1项下的操作要点，进行单因素发酵试验，以酒精度及感官评分为评价标准，确定各单因素对芒果蜂蜜果酒的影响。

1.3.3 响应面法优化芒果蜂蜜果酒发酵工艺

表1 Box-Behnken试验设计因素与水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

参考相关文献[11，14]，并在单因素试验的基础上，选择果浆的初始pH值为3.6和发酵时间为10 d，利用Box-Behnken试验设计对酵母添加量（A），初始糖度（B）及发酵温度（C）3个主要因素进行优化，以酒精度（Y1）和感官评分（Y2）为响应值进行响应面试验。试验设计因素与水平见表1。

1.3.4 感官评分

参照国标GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》对芒果蜂蜜果酒进行感官评分[21]，选10名食品专业人员分别对芒果蜂蜜果酒产品的色泽、香气、澄清度、滋味、典型性进行感官评分，满分100分，具体感官评分标准见表2。

表2 果酒感官评分标准Table 2 Sensory evaluation standards of wine

1.3.5 芒果蜂蜜果酒质量指标的检测

酒精度：参照国标GB 5009.225—2016《酒中乙醇浓度的测定》中的酒精计法[22]；糖度、酸度：分别采用糖度计和酸度仪进行测定；总酸（以酒石酸计）：电位滴定法[21]；总糖（以葡萄糖计）测定：直接滴定法[21]。细菌总数、大肠杆菌的测定：参照国标GB 4789.2—2016《食品微生物学检验菌落总数测定》[23]；致病菌的测定：参照国标GB 29921—2013《食品中致病菌限量》[24]。

1.3.6 数据处理

试验所得数据为3次重复实验的平均值。采用Origin 7.5作图，采用Design-Expert 8.0.6软件进行响应面分析。

2 结果与分析

2.1 发酵工艺优化单因素试验

2.1.1 酵母添加量对芒果蜂蜜果酒的影响

图1 酵母添加量对芒果蜂蜜酒感官评分和酒精度的影响Fig.1 Effect of yeast inoculum on sensory score and alcohol content of mango and honey wine

由图1可知，随着酵母接种量的增加，酒精度和感官评分先快速升高后迅速降低，当选择0.04%作为酵母添加量时，发酵产生的果酒酒精度低，感官评分较低，说明酵母添加量过少，发酵速度慢，发酵不彻底；当接种量为0.10%时，芒果蜂蜜酒酒精度出现最大值为（11.3±0.2）%vol，但再继续增加酵母接种量，出现果浆中糖分过多而促进了酵母菌的生长繁殖，反而不利于发酵，酒精度随之下降，同时，接种量为0.06%时，果酒感官评分达到最大值为（79.1±0.5）分，之后继续增加酵母接种量，酒体含糖下降，酸度升高，可能是接种密度过大，导致发酵液中溶氧不足，从而抑制了酵母的生长，不利于香气物质的形成，口感变差。因此，考虑果酒的口感，选择最适酵母添加量为0.06%。

2.1.2 初始糖度对芒果蜂蜜果酒的影响

图2 初始糖度对芒果蜂蜜果酒感官评分和酒精度的影响Fig.2 Effect of initial sugar content on sensory score and alcohol content of mango and honey wine

由图2可知，当初始糖度为16%～18%时，酒中酒精度较低，醇香味较淡，使得果酒的典型性和滋味不突出，对口感有着消极影响，导致发酵果酒风味不佳，表明此时糖度不足；在初始糖度为20%时，酒样中酒精度和感官评分高，分别为（11.2±0.2）%vol和（76.2±0.4）分，果酒风味更好，表明此时糖度对发酵果酒比较适宜；当初始糖度为＞22%之后，发酵的酒样中酒精度偏高，果酒口感偏甜，感官评分降低，说明此时的初始糖度过高。因此，选择最适初始糖度为20%。

2.1.3 发酵温度对芒果蜂蜜果酒的影响

图3 发酵温度对芒果蜂蜜酒感官评分和酒精度的影响Fig.3 Effect of fermentation temperature on sensory score and alcohol content of mango and honey wine

由图3可知，酒精度和感官评分随发酵温度在20～26 ℃范围的升高而增加，当发酵温度在26 ℃时，果酒酒精度和感官评分达到最大值，分别为（12.4±0.1）%vol和（78.8±0.3）分；而后随发酵温度＞26 ℃之后，温度过高使酵母菌生长速度较快，致酵母衰老加速（活性受到抑制），不能在发酵后期将发酵液中的糖有效转化成酒精，会影响产酒精量，酒精度由此开始缓慢下降，且酒体粗糙，酒质容易氧化，口感变差，感官评分降低。因此，选择最适发酵温度为26 ℃。

2.1.4 发酵时间对芒果蜂蜜果酒的影响

图4 发酵时间对芒果蜂蜜酒感官评分和酒精度的影响Fig.4 Effect of fermentation time on sensory score and alcohol content of mango and honey wine

由图4可知，当经过6～8 d发酵时，酒样中酒精度较低，感官评分较低，说明发酵时间较短，发酵过程不彻底；对于发酵10 d时，果酒酒样中的酒精度和感官评分继续上升趋势，表明随着发酵时间的增加果酒品质继续提高；当发酵12～14 d时，感官评分降低，酒精度偏高，可能由于出现轻微的酸败现象（抑制酵母的酒精产生能力并将部分酒精转化为酸），酵母菌进入衰减阶段，菌体沉降死亡，酒体中溶入菌体内容物而影响感官评价值。因此，选择最适发酵时间为10 d。同时，考虑到发酵时间对整个发酵影响并不明显，故而在响应面试验中发酵时间不作为考察因子进行考虑。

2.1.5 初始pH值对芒果蜂蜜果酒的影响

图5 初始pH值对芒果蜂蜜酒感官评分和酒精度的影响Fig.5 Effect of initial pH value on sensory score and alcohol content of mango and honey wine

由图5可知，发酵时间对发酵的感官评分影响不大，当pH值为3.2～3.4 时，果酒酒精度较低，感官评分低，口感风味较差，说明pH值过低导致酵母的生长受到了抑制，发酵速度慢，不利于果酒风味物质的形成。当pH值为3.6时，发酵生产的果酒酒精度较高，感官评分最高，分别为（10.6±0.2）%vol和（77.5±0.5）分，说明此pH值下发酵的果酒风味更好，酵母生长不受抑制。当pH值为4.0时，酒精度降低，感官评分较低，说明pH值过高，可能出现杂菌生长较快，影响酵母的正常生长代谢。由此可知，选择最适初始pH值为3.6。同时，考虑到初始pH值对整个发酵影响并不明显，故而在响应面试验中初始pH值不作为考察因子进行考虑。

2.2 响应面法分析结果

以酵母添加量（A），初始糖度（B）及发酵温度（C）为影响因素，以酒精度（Y1）和感官评分（Y2）为响应值，利用Design Expert 8.06响应面软件的Box-Behnken试验设计3因素3水平试验，试验设计结果与分析见表3，方差分析结果见表4。

对获得的数据利用分析软件Design-Expert进行多元回归方程拟合，得酒精度（Y1）和感官评分（Y2）二次多项回归模型方程为：

表3 Box-Behnken试验设计结果与分析Table 3 Results and analysis of Box-Behnken experiments design

表4 回归模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

由表4方差分析结果可知，以响应曲面法建立的二次回归模型方程，其2个模型均极显著（P＜0.01），且失拟项均不显著（P＞0.05），说明此2个模型是可靠的。酒精度和感官评分的校正决定系数R2为97.40%和99.44%，说明该模型的拟合程度较好，采用响应曲面法优化建立的芒果蜂蜜发酵工艺回归方程（模型）是有效的。以酒精度为响应值时，一次项C和交互项AB影响显著（P＜0.05），A、A2、B2、C2影响极显著（P＜0.01），由F检验可以得到因子贡献率为A＞C＞B；以感官评分为响应值时，一次项C、交互项AB、AC、BC和二次项A2、B2、C2影响极显著（P＜0.01），由F检验可以得到因子贡献率为C＞A＞B。

各因素对指标影响的响应面及等高线结果见图6。由图6可知，在Y1模型中BC、AC交互作用不显著，因此只对AB交互作用进行分析，保持发酵温度不变时，酒样中酒精度随着初始糖度与酵母量的增加呈现先升高后下降的趋势，且等高线呈现椭圆形，存在极值，曲面较为陡峭，交互作用显著。在Y2模型中等高线最小椭圆的中心点为响应面的最高点，即感官评分最高，等高线的形状为椭圆形，曲面倾斜度越高，坡度越陡，各因素对感官评分的影响越显著，说明AC、BC、AB交互作用显著。

应用响应面寻优分析方法对回归模型进行分析，选择酒精度和感官评分的重要性均为5，分别选择酒精度和感官评分的最大响应值，寻找最优响应结果为酵母添加量0.06%，初始糖度19.99%，发酵温度25.96 ℃。此优化条件下发酵后果酒酒精度预测值为11.23%vol，感官评分预测值为83.37分。为验证试验结果的真实性，考虑实际的操作情况，将发酵工艺参数调整为酵母添加量0.06%，初始糖度20%，发酵温度26 ℃，在此发酵工艺条件下，进行6次验证试验，芒果蜂蜜果酒的感官评分实际值为83.20分，酒精度实际值为11.25%vol，结果与预测值相差微小，证明该回归模型可靠，可以应用响应面，优化芒果蜂蜜果酒发酵工艺可行。

图6 初始糖度、酵母添加量和发酵温度交互作用影响芒果蜂蜜酒感官评分和酒精度的响应面及等高线Fig.6 Response surface plots and contour lines of interaction between initial sugar,yeast inoculum and fermentation temperature on sensory score and alcohol content of mango and honey wine

2.3 芒果蜂蜜果酒的质量指标检测结果

采用最佳发酵条件得到芒果蜂蜜果酒，其酒精度为11.0%vol，总糖（以葡萄糖计）为12.3 g/L，总酸（以酒石酸计）为6.2 g/L；细菌总数（21 CFU/mL）≤50 CFU/mL，大肠杆菌（1 MPN/100 mL）≤3 MPN/100 mL，致病菌未检出。结果表明该芒果蜂蜜果酒的理化指标及微生物指标均符合国家标准[25]。

3 结论

以凯特芒果和野拔子蜂蜜为原料，通过单因素试验，结合响应面分析法优化芒果蜂蜜果酒酿造工艺条件，得到最佳优化发酵工艺参数为酵母添加量为0.06%，初始糖度为20%，发酵温度为26 ℃。在此发酵工艺条件下，得到芒果蜂蜜果酒的感官评分为83.0分，酒精度为11.0%vol，其芒果蜂蜜酒呈橙黄色，酒体澄清透明，酒香浓郁，口感柔和，带有淡淡的芒果风味。该研究不仅开发一款营养丰富的休闲果酒，也得到较优的芒果蜂蜜果酒发酵工艺参数，为其生产化提供了一定参考意义。