脂质体包覆的多重响应性PDMAEMA纳米凝胶的研究

邓联东，赵晓青，董岸杰, 2，张建华, 3



脂质体包覆的多重响应性PDMAEMA纳米凝胶的研究

邓联东1，赵晓青1，董岸杰1, 2，张建华1, 3

(1. 天津大学化工学院，天津 300072；2. 天津化学化工协同创新中心，天津 300072；3. 天津大学天津膜科学与海水淡化技术重点实验室，天津 300072)

纳米载体中药物的环境响应性释放在生物医学领域具有重要意义．本文以脂质体为模板，pH和温度双响应的甲基丙烯酸二甲氨乙酯(DMAEMA)为单体，水溶性还原敏感的胱氨酸甲基丙烯酸酯(CDA)为交联剂，通过模板原位聚合法制备了脂质体包覆的pH、温度、还原多重响应性纳米凝胶(lipogels)．通过透射电镜(TEM)观察lipogels形貌，采用激光粒度仪探究不同刺激条件及牛血清白蛋白(BSA)对lipogels粒径的影响．并以盐酸阿霉素为亲水性药物模型，研究不同刺激条件下lipogels的药物释放行为．结果表明，模板原位聚合法制备的lipogels呈均一的球形结构，粒径随pH值降低而增大，随温度升高而变小，在还原剂作用下lipogels结构被破坏，形貌呈碎片状．同时，lipogels具有良好的抗蛋白吸附稳定性和良好的血液相容性．体外药物释放行为表明该lipogels具有pH、还原、温度多重响应性．

脂质体；聚甲基丙烯酸二甲氨乙酯(PDMAEMA)；纳米凝胶；多重响应；药物释放

肿瘤细胞与正常细胞微环境有显著差异，研究发现，肿瘤细胞外pH值为6.8~7.2，较正常细胞(pH＝7.4)低；肿瘤细胞中内涵体和溶酶体pH值为4.0～6.0，远低于正常细胞；同时，肿瘤细胞中谷胱甘肽(GSH)浓度为2～10,mmol/L，比正常细胞浓度(2～10,μmol/L)高数千倍．因此，根据肿瘤细胞有别于正常细胞的特异性，构建生物相容性好、结构稳定、能响应肿瘤细胞内特异性刺激的“智能”药物递送载体成为提高抗癌药物递送效率的关键．

纳米凝胶由于其良好的生物相容性、水分散性、机械稳定性、高的亲水性药物负载能力以及特定的环境响应能力得到了广泛关注．此外，纳米凝胶柔软性好，类似于人体的软组织，可通过降低巨噬细胞的吞噬延长血液循环时间，而且柔软的纳米凝胶更易渗透到肿瘤组织，因此纳米凝胶在生物医学和制药领域很有吸引力[1-2]．阳离子聚甲基丙烯酸二甲氨乙酯(PDMAEMA)凝胶，由于其良好的pH、温度和离子强度等多重响应性，广泛用于药物/基因/蛋白的递 送[3-4]．但是，PDMAEMA纳米凝胶在形貌控制、批量重复制备以及血液循环稳定性上仍面临巨大挑战．因此，寻求新的方法制备粒径均一、生物相容性好、循环稳定性高和药物响应性释放的PDMAEMA基纳米凝胶至关重要．

将微/纳米物质包封到脂质体内核构建脂质体包覆的杂化纳米粒，这为药物负载和递送提供了一种创新而高效的方法[5-6]．脂质体作为保护层，提高了载体生物相容性，增强了血液稳定性[7]．受此启发，并结合肿瘤细胞微环境特征，本文采用模板原位聚合法制备脂质体包覆的多重响应性PDMAEMA纳米凝胶，以实现pH、温度、还原多重响应．实验采用透射电镜观察lipogels的形貌，通过激光粒度仪研究不同刺激条件及BSA蛋白对lipogels粒径的影响，通过溶血实验探究lipogels与血液中红细胞的相容性，并以盐酸阿霉素为药物模型，研究载药lipogels在pH、温度和还原剂多重刺激下的药物控释行为．

1 实 验

1.1 实验原料

蛋黄卵磷脂(BR)、胆固醇(95%,)购自上海源叶生物科技有限公司；DSPE-PEG2000(98%,)、甲基丙烯酸二甲氨乙酯(99%,)、偶氮二异丁基脒盐酸盐(97%,)、抗坏血酸(99%,)、盐酸阿霉素(98%,)、还原型谷胱甘肽(98%,)、聚乙二醇辛基苯基醚(TX-100)(生化试剂级)均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；水溶性胱氨酸甲基丙烯酸酯(CDA)为实验室自制，制备方法见文献[8]；大分子阻聚剂PEG-TEMPO为实验室自制，制备方法见文献[9]；三氯甲烷、无水磷酸氢二钠、无水磷酸二氢钾、柠檬酸、氯化钠、氯化钾均为分析纯试剂，购自利安隆博华(天津)医药化学有限公司．

1.2 lipogels的制备

如图1所示，称取48,mg蛋黄卵磷脂、8,mg胆固醇、8,mg DSPE-PEG2000溶于三氯甲烷，待原料溶解后，旋蒸除去溶剂，使其在茄形瓶底形成脂质膜．将溶有0.45,g单体DMAEMA、9,mg引发剂V-50和50,mg交联剂CDA的6,mL水溶液加入茄形瓶，水化薄膜；然后将样品置于细胞粉碎仪探头下，400,W超声10,min，形成内腔为纳米凝胶预聚溶液的脂质体囊泡；随后加入大分子阻聚剂PEG-TEMPO(阻止脂质体外单体的聚合)，通入惰性气体氮气，将反应管置于40,℃水浴锅反应4,h．

1.3 载药lipogels的制备

步骤同上，在茄形烧瓶底部形成脂质膜后，用溶有4,mg/mL盐酸阿霉素的单体、引发剂、交联剂预聚水溶液(用量同上)水化脂质体薄膜，超声形成载药脂质体纳米凝胶预聚溶液，按上述步骤反应．

图1 lipogels的制备路线及药物释放过程

1.4 粒径测定

取1,mg/mL的lipogels溶液，用激光粒度仪(Nano ZS，英国马尔文)分别检测不同pH值、不同温度下lipogels的粒径．随后用TX-100(一种表面活性剂，可溶解脂质膜)处理不同pH值下的lipogels溶液30,min，测量粒子粒径分布．取经TX-100处理的pH值为5.0的lipogels溶液，加入还原型谷胱甘肽GSH(10,mmol/L)，处理24,h，测量粒径分布．以上测试条件为：温度25,℃，角度173°，扫描波长为633,nm，扫描12次，每次间隔2,s，均重复3次，取3次测量平均值作为最终测试结果．

1.5 形貌表征

将lipogels及经TX-100和GSH同时处理的lipogels溶液滴到碳膜铜网上，自然晾干，通过TEM观察经GSH处理前后纳米凝胶的形貌变化．

1.6 抗蛋白吸附稳定性研究

分别取质量浓度为1,mg/mL的lipogels溶液和牛血清白蛋白(BSA)溶液，二者等体积混合，置于37,℃的恒温振荡器中孵育2,h、4,h、8,h、18,h、24,h、48,h，并在特定的时间点取样，通过激光粒度仪测试粒径分布及变化，每个样测试3次，取3次测量平均值作为最终测试结果．

1.7 药物控释行为研究

1.7.1 载药量和包封率的测定

将载药lipogels置于1,000,mL PBS溶液中透析12,h，采用紫外分光光度计(UV-Vis)测定透析液中药物吸光度，结合盐酸阿霉素的标准曲线，计算透析液中药物含量，用总投药量减去透析液中药物量即为包封药物量．包封率(%)和载药量(%)计算式分别为

1.7.2 pH、还原双响应药物控释

载药lipogels置于透析袋(分子截留量：8,000)，将其浸入装有15,mL不同pH值的缓冲溶液(10,mmol/L pH值分别为7.4、6.5和5.0的PBS)以及GSH浓度为10,mmol/L的上述不同pH值溶液，每组设置3个平行样，然后将各组样品放于37,℃、70,r/min的恒温振荡器，在特定的时间点取5,mL释放液，同时补充5,mL新鲜缓冲液．利用UV-Vis测定取出释放液的吸光度，根据盐酸阿霉素标准曲线计算浓度和药物累积释放量，绘制释放曲线．药物累计释放量计算式为

式中：r为药物累计释放量，%；DOX代表透析袋中盐酸阿霉素的总量；e代表PBS的置换体积(5,mL)；0代表释放液总体积(15,mL)；c、c代表盐酸阿霉素的浓度，其中、为取样次数．

1.7.3 温度响应性药物控释

将装有载药lipogels的透析袋放入pH＝7.4的PBS缓冲溶液中，分别置于25,℃、37,℃和60,℃水浴锅中，每组设置3个平行样，按照上述步骤在特定的时间点取样，计算药物累积释放量，绘制释放曲线．

1.8 溶血实验

取新鲜全血至用抗凝剂肝素预处理的采血管中，加入无菌PBS，1,500离心5,min，反复重复上述步骤，直到上清液澄清透明．收集红细胞并在无菌PBS中重新悬浮(最终质量分数为1%,)．将红细胞悬浮液与lipogels溶液混合，lipogels质量浓度为100,µg/mL的样品作为实验组，红细胞悬浮液与无菌水混合作为阳性对照，与无菌PBS混合作为阴性对照．每组设置3个平行样，在37,℃下培育4,h，随后以1,500的转速将混合液离心5,min．各取100,µL上清液至96孔板中，用酶标仪测试上清液在545,nm处的光密度值(OD)．样品溶血率(%)计算式为

2 结果与讨论

2.1 多重刺激对lipogels粒径的影响

2.1.1 pH值对lipogels粒径的影响

PDMAEMA是一种pH敏感的聚合物，pKa约为7.5，当pH值降低时，PDMAEMA侧链的叔胺质子化，链段由于电子相斥而舒展，交联的PDMAEMA纳米凝胶结构变得松散，PDMAEMA水溶性增强，吸水后结构膨胀体积增大，且pH值越低，膨胀率越大[10]．如图2(a)所示，从pH＝7.4到pH＝6.5，lipogels粒径几乎没变，这可能是由于pH值处于6.0～7.0(质子缓冲区域)时，PDMAEMA侧链上的叔胺保持了适当的电离状态，保有一定的质子缓冲能力[11]．当pH值降低到5.0时(溶酶体酸性环境)，PDMAEMA侧链叔胺完全质子化，PDMAEMA纳米凝胶交联网状结构斥力增大，吸水膨胀导致粒径增大，lipogels粒径由pH＝7.4的110,nm增大到pH＝5.0的150,nm．如图2(b)所示，lipogels经TX-100处理，脂质膜被溶解形成20,nm左右的脂质胶束，PDMAEMA纳米凝胶暴露(100,nm后的粒径峰)．由图2(a)和(b)可知，与原始lipogels(pH＝7.4)的110,nm相比，暴露的PDMAEMA纳米凝胶平均粒径增加到约280,nm，一方面由于暴露的PDMAEMA纳米凝胶吸水体积变大，另一方面可能由于PDMAEMA纳米凝胶去除脂质膜后本身不稳定，容易聚集，导致粒径变大．另外，图2(b)中pH＝5.0条件下，粒径较pH值为7.4和6.5条件PDMAEMA纳米凝胶的粒径显著增大，体现了PDMAEMA纳米凝胶的pH值响应性体积膨胀.

（a）lipogels在不同pH值下的粒径分布

（b）lipogels在不同pH值、TX-100处理下的粒径分布

图2 pH对lipogels粒径的影响

Fig.2 Effect of pH on the size of lipogels

2.1.2 GSH对lipogels粒径的影响

Lipogels内核PDMAEMA通过含有二硫键的CDA交联，在还原剂环境下，CDA的二硫键断裂，可实现内核PDMAEMA的可解体性，增强生物相容性的同时加快药物释放．如图3所示，虽然GSH没有完全使100,nm之后的PDMAEMA纳米凝胶解体，但PDMAEMA纳米凝胶峰强度降低，说明GSH使内核PDMAEMA纳米凝胶部分网状结构解体．

图3 GSH对lipogels粒径的影响

2.1.3 温度对lipogels粒径的影响

PDMAEMA纳米凝胶在热刺激下会发生形状或性质变化，如图4所示，25,℃下lipogels平均粒径约122,nm，温度升高到60,℃，平均粒径变小到约95,nm．这是由于温度高于PDMAEMA的低临界溶解温度LCST(44~50,℃)时，PDMAEMA链段变疏水，构象变化使lipogels发生收缩，粒径变小．如图5(a)和(b)所示，lipogels分散液在LCST以下保持透明，丁达尔效应明显，表明这是一个非常稳定的分散状态．将lipogels分散液加热到60,℃，如图5(c)和(d)所示，分散液变混浊，且丁达尔光路变差，说明随着温度升高，PDMAEMA链疏水相互作用增强使凝胶疏水析出，宏观表现为溶液变白变浑浊．

图4 lipogels在25,℃和60,℃的粒径分布

图5 lipogels溶液的温度响应

2.2 GSH对lipogels形貌的影响

图6(a)为lipogels的TEM照片，lipogels呈球形，尺寸均一，分散稳定性良好，平均粒径约103,nm．图6(b)lipogels在GSH处理下形貌变得不均一，由球形变为零散片状，这是由于GSH使交联剂CDA的二硫键断裂，PDMAEMA纳米凝胶交联网状结构被破坏，因此呈现碎片状形貌．

（a）lipogels的TEM照片

（b）lipogels经TX-100、GSH处理24,h后的TEM照片

图6 lipogels经TX-100、GSH处理前后的透射电镜照片

Fig.6 TEM images of lipogels before and after being treated with TX-100 and GSH

2.3 抗蛋白吸附稳定性

脂质体可以有效防止蛋白吸附，避免载体被生物系统清除，进而延长体循环时间．由图7(a)可知在前24,h粒径分布宽度几乎不变，48,h后粒径分布稍变宽．图7(b)显示，前24,h孵育过程中lipogels粒径稍有变大，但随着时间延长，这种变化趋于稳定，且与BSA蛋白共孵育48,h后的lipogels粒径依然在肿瘤高渗透性与滞留效应(EPR)范围内，因此，lipogels具有较好的抗蛋白吸附稳定性．

（a）BSA与lipogels作用时间对lipogels粒径的影响

（b）BSA与lipogels作用不同时间的粒径变化

图7 lipogels的抗蛋白吸附稳定性

Fig.7 Anti-protein adsorption stability of lipogels

2.4 多重响应性药物控释行为研究

以亲水性药物盐酸阿霉素为药物模型，探究lipogels的pH、还原、温度多重响应性药物释放行为.

如图8所示，在相同pH值下，GSH显著加快了盐酸阿霉素的释放，表明载体具有良好的还原响应性．无论有无GSH处理，pH值为5.0的释放量明显高于pH值为7.4的释放量，这是由于低pH环境下凝胶网络结构膨胀变松散，加快了药物释放．如图9所示，随着温度升高，盐酸阿霉素释放明显加快，这是由于PDMAEMA在高于其LCST时发生相转变，链段由亲水变为疏水，凝胶网络结构收缩，挤压释放了更多盐酸阿霉素，表明载体具有温度敏感性．综上，对于肿瘤细胞溶酶体弱酸环境(pH＝5.0)、细胞质中高GSH浓度(10,mmol/L)以及外界高温刺激作用，本实验制备的多重响应lipogels有望在肿瘤细胞内快速高效释药．

图8 体外pH、还原双响应药物释放曲线

Fig.8 In vitro pH/redox dualresponsive drug release curve

图9 体外温度响应药物释放曲线

Fig.9 In vitro temperature-responsive drug release curve

2.5 溶血实验

血液相容性是纳米药物递送载体生物相容性的重要指标之一．阳离子PDMAEMA带正电荷，与红细胞作用使细胞膜变形，因此一般阳离子聚合物易产生溶血．对于材料的溶血率，小于5%,视为血液相容性好，且溶血率越小越好．如图10所示，图中无菌水作为阳性对照，100%,溶血，PBS为阴性对照，lipogels实验组较PBS组溶血率更小，可认为lipogels有良好的血液相容性．由于脂质体有效地将PDMAEMA纳米凝胶包覆在脂质体内腔，因此解决了PDMAEMA溶血问题，提高了生物相容性．

（a）溶血照片

（b）溶血率柱状图

图10 lipogels与红细胞培育4,h的溶血照片及溶血率柱状图

Fig.10 Photographs of hemolysis of lipogels incubated with erythrocytes for 4,h and hemolytic ratio his-togram

3 结 语

本文通过模板原位聚合法成功制备了脂质体包覆的多重响应性PDMAEMA纳米凝胶．脂质体不仅作为聚合模板制得了尺寸均一的PDMAEMA纳米凝胶，而且提高了PDMAEMA的抗蛋白吸附稳定性和血液相容性．亲水性药物盐酸阿霉素包封在PDMAEMA纳米凝胶内，通过凝胶对pH、温度、还原剂的多重响应性实现了药物控释．这种多重响应的脂质体纳米凝胶在智能药物递送体系中具有很好的应用前景．

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Investigation on Liposome-Coated Multi-Responsive PDMAEMA Nanogels

Deng Liandong1，Zhao Xiaoqing1，Dong Anjie1, 2，Zhang Jianhua1, 3

(1．School of Chemical Engineering and Technology，Tianjin University，Tianjin 300072，China；2．Collaborative Innovation Center of Chemical Science and Engineering(Tianjin)，Tianjin 300072，China；3．Tianjin Key Laboratory of Membrane Science and Desalination Technology，Tianjin University，Tianjin 300072，China)

The environment-responsive release behavior of drugs in nanocarriers is of great significance in biomedicine．Using liposome as a template，pH and temperature dual-responsive 2-(dimethylamino)ethyl methacrylate(DMAEMA)as a monomer，and hydrophilic redox-cleavable cystine methacrylate(CDA)as a crosslinking agent，liposome-coated pH，temperature and redox multi-responsive PDMAEMA nanogels(lipogels)were prepared by in situ template polymerization．The morphology of lipogels was observed by transmission electron micros-copy(TEM)．The effects of different stimulus conditions and bovine serum albumin(BSA)on the size of lipogels were measured by laser particle sizer．Using doxorubicin hydrochloride as a hydrophilic drug model，the multi-stimulated drug release behavior of lipogels was investigated．The results show that lipogels are uniform spherical structure，and their size increases as the pH or temperature decreases．Lipogels become fragmented when treated with a reducing agent．Meanwhile，lipogels have good anti-protein adsorption stability and blood compatibility．The drug release behavior indicates that lipogels are multi-responsive to pH，redox and temperature.

liposome；poly(2-(dimethylamino)ethyl methacrylate)(PDMAEMA)；nanogel；multi-responsive；drug release

R945

A

0493-2137(2019)01-0007-06

2018-03-21；

2018-04-02.

邓联东（1969—  ），男，博士，副教授，dengliandong@tju.edu.cn.

张建华，jhuazhang@tju.edu.cn.

国家自然科学基金资助项目(31470925，31671021，31470963)；天津市应用基础与前沿技术研究计划资助项目(15JCQNJC03000).

the National Natural Science Foundation of China(No.31470925，No.31671021，No.31470963)，the Tianjin Research Program of Application Foundation and Advanced Technology(No.15JCQNJC03000).

10.11784/tdxbz201803070

(责任编辑：田 军)