胞外组蛋白与急性器官损伤的关系

王宏鑫，王 萌，张煜伟，李光宗 综述 王力军 审校

组蛋白是真核生物染色体的基本结构蛋白。细胞内组蛋白由五种蛋白构成：H2A、H2B、H3、H4以八聚体的形式，组成核小体的核心结构；H1位于核小体以外，稳定染色质三级结构。H1、H2A和H2B富含赖氨酸，而H3和H4主要由精氨酸组成。作为核小体骨架，胞内组蛋白具有维持染色体稳定、参与DNA的转录、复制及修复等功能[1]。若胞内组蛋白易位至细胞外，即为细胞外组蛋白(extracellular histone, EH)。EH通过影响TLR2/TLR4/TLR9信号通路、增加细胞膜通透性介导炎性反应、激活血小板及中性粒细胞等，对脑、心脏、肺脏、肝脏、肾脏和胰腺等造成损伤，甚至发生多器官衰竭[2]。笔者就EH对器官损伤及其发病机制做一综述。

1 EH的来源及影响

EH多来源于细胞凋亡或坏死时染色质发生降解，以游离组蛋白、DNA结合组蛋白(核小体)及中性粒细胞胞外陷阱(neutrophil extracellular traps, NETs)形式释放到胞外[3]。游离型即刻致死性明显高于结合型。肽基精氨酸脱亚氨酶4(peptidylated arginine deaminase,PAD4)促进组蛋白中精氨酸瓜氨酸化，诱发DNA解螺旋，导致细胞死亡[4]。少量组蛋白可迅速被单核巨噬细胞清除。患者感染脓毒症等疾病时，细胞死亡释放的组蛋白超过机体清除能力，EH水平升高。

固有免疫细胞死亡时释放包含组蛋白的NETs，此过程称为NETosis。NETs兼具保护和损伤机体的作用。机体感染时中性粒细胞释放的颗粒蛋白和染色质形成保护网，过滤并杀死致病菌[4]。NETosis亦可导致血小板聚集、血栓形成、自身免疫和细胞毒性[5]。NET诱导的血管内凝血取决于H4、血小板和无机多磷酸盐之间的相互作用[5，6]。目前尚不清楚NETosis的始动机制[7]。但更多证据表明TLR2/TLR4和补体在启动固有免疫细胞死亡中可能发挥重要作用[8，9]。

2 EH介导炎性反应的机制

2.1 通过TLR信号通路 缺血、创伤等触发内皮细胞死亡，胞内物质(如组蛋白等)释放到细胞外。这些物质结合、激活特异Toll样受体(toll like receptors, TLRs)，提高NF-κB介导的促炎因子转录。缺氧性线粒体功能障碍后活性氧(reactive oxygen species, ROS)增加，上调TLRs。活化TLR(尤其是TLR2和TLR4)通过MyD88-依赖途径促进IL-6和TNF-α等促炎因子释放。此外，TLR还介导损伤相关分子信号传递。TLR2和TLR4基因敲出小鼠模型可免于致死剂量组蛋白的危害，提示EH可能通过TLR2和TLR4发挥作用[10，11]。

在肝缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury, I/R)模型中，EH介导TLR9活化，诱导IL-6和TNF-α等促炎因子释放[12，13]。在无菌性炎性反应中，TLR9的活化可能有助于NLRP3炎性小体的聚集。在枯否细胞中，激活的组蛋白-TLR9介导线粒体ROS生成及活化NLRP3炎性小体。TLR9和NLRP3基因敲除后可完全阻断以上过程[14]。EH激活TLR9的原因可能是结合组蛋白DNA发挥DNA-TLR9-依赖的损伤相关分子的作用，同时增强DNA-TLR9信号传导[13]。

2.2 增加胞膜通透性 EH对上皮和内皮组织可直接产生细胞毒性作用。注射高剂量EH后，细胞活性显著降低。Pereira等[15]首先论述阳离子组蛋白和阴离子磷脂之间的离子键合。EH与磷脂-磷酸二酯键结合后，改变膜通透性，促进钙离子内流，导致细胞功能降低[16]。C-反应蛋白通过竞争结合磷脂位点，阻断EH与其结合，使其不能进入胞内，发挥抑制钙内流及保护细胞免受EH毒性的作用[17]。

此外，EH可活化血小板。血小板活化后释放Poly P，进而激活FⅫ和补体，促进凝血和组织损伤、水肿和炎性反应。激活的血小板和中性粒细胞，促进NETosis，提高EH水平。此过程相互促进，形成恶性循环，最终导致多器官损伤[2]。

3 EH与急性器官损伤的关系

3.1 脑 脑血管病是全球发病率和病死率最高的疾病之一。栓塞致脑灌注急剧减少及不可逆性炎性神经损伤。低氧灌注刺激胞内核小体释放到循环系统。与对照组相比，暴露于缺氧环境的小鼠核小体水平升高3倍，而缺血性卒中模型显示核小体水平升高达7倍[18]。EH在I/R模型中的负性作用可能是对内皮细胞及血脑屏障造成直接毒性作用、提高其通透性及白细胞迁移和免疫刺激[18]。另外，EH激活血小板，再灌注期时可进一步增加缺血风险[19]。

阿尔茨海默病和帕金森等神经炎性疾病患者EH水平升高[20]。EH损伤胶质细胞，影响其功能。免疫源性的小胶质细胞在此病理过程中发挥重要作用。实验表明H1(而非核心组蛋白)通过促进小胶质细胞存活，具有剂量依赖的神经毒性[21]。此外，H1通过激活星型胶质细胞，提高其反应性，发挥神经免疫调节功能。

3.2 心脏 心肌损伤与I/R后氧输送减少、胞内免疫源性物质(如组蛋白)释放有关。反复缺血常导致发生不可逆性心肌损伤，出现心力衰竭。心肌梗死早期即发现组蛋白积聚于心肌细胞内，心肌损伤程度与组蛋白水平相关[22]。NETs释放的核小体也参与心脏局部缺血后的炎性信号传导。缺乏PAD4酶的小鼠心肌梗死后血核小体水平较低。能够水解NETs的脱氧核糖核酸酶1(deoxyribonuclease1, DNase1)显著改善心室重塑，提高局部心肌细胞存活率，改善心肌功能并减少中性粒细胞浸润。可能是因DNase1分解组蛋白，预防进一步的心脏毒性。但EH仍可随血流传播，损伤其他器官[23]。此外，EH尚可通过补体系统诱导脓毒症心肌损伤[23]。

3.3 肺脏 输血、创伤或缺血引起的急性肺损伤，常影响肺泡及内皮细胞功能，导致气体交换不足、蛋白渗出增加、细胞死亡、炎性反应甚至呼吸衰竭。输血后可出现显著的NETs介导的炎性反应[24]。NETs可加重肺水肿，提高血管内皮通透性[23]。目前尚不明确组蛋白、DNA及颗粒蛋白在NETs内，抑或组成复合物介导肺的炎性反应或细胞死亡。Caudrillier等[24]发现，注射EH后小鼠肺泡细胞活性明显下降，预孵育抗组蛋白(H1-DNA、H2A、H2B和H4)抗体显著降低NETs介导的细胞毒性。进一步研究显示H1和H4(非H3)诱导肺细胞死亡，抗H4抗体显著降低促炎信号传导及急性肺损伤严重程度，而抗H3抗体无此作用[8]。

免疫组化显示组蛋白与磷脂上的磷酸二酯键相互作用(类似于DNA-组蛋白结合位点)，积聚在内皮细胞膜周围，导致膜通透性增加，钙离子内流和细胞死亡[25]。提示游离组蛋白具有非特异性、不依赖于TLR的细胞毒性作用。此外，阴离子聚糖及聚唾液酸通过结合EH，发挥保护作用[23]。

3.4 肝脏 无菌性肝炎时EH激活枯否细胞的TLRs，启动细胞因子风暴[11]。刀豆素和对乙酰氨基酚诱导的急性肝损伤模型中，EH水平升高，抗组蛋白治疗及敲除TLR2/TLR4则具保护作用[10]。EH通过TLR4/TLR9刺激中性粒细胞形成NETs。NETs刺激免疫源性枯否细胞释放促炎因子。与急性肺损伤不同，H3与肝损伤程度具有显著的相关性，抗H3抗体可减轻肝损伤严重程度，同时降低死亡风险和血清TNF-α和IL-6水平。NETs也介导肝细胞毒性[26]。NETosis抑制剂、PAD4抑制剂和DNase1均可降低EH介导的NETs和肝损伤标志物水平。

3.5 肾脏 急性缺血性肾损伤临床常见，发病率和病死率高。急性肾缺血时，组蛋白通过坏死的肾小管上皮细胞释放到细胞外。EH依剂量依赖性的方式，对肾内皮细胞和肾小管上皮细胞产生毒性。表现为白细胞黏附、血管通透性增加和肾动脉内跨内皮迁移。使用抗H4抗体中和组蛋白活性后，细胞因子及趋化因子表达降低[27]。TLR2/TLR4可能通过MyD88-NFκB及MAPK途径，介导并激活促炎反应；MyD88和TLR双敲除的动物，促炎反应降低[28]。

3.6 胰腺 EH水平与胰腺腺泡坏死数量和严重程度紧密相关。胰腺灌注降低后即出现胰腺损伤，表现为胰酶升高和组织炎性反应。在胆囊结石和胆囊收缩素诱导的坏死性胰腺炎中，EH水平明显升高，而单纯水肿和炎性反应不会导致EH升高。此外，高迁移率族组蛋白-1(high mobility group box protein-1，HMGB-1)能够保护细胞免受氧化应激和DNA断裂，EH通过促进固有免疫细胞分泌HMGB-1，导致胞内HMGB-1水平降低，从而加剧胰腺腺泡细胞DNA损伤[1]。胰腺炎时EH水平升高能与HMGB-1缺乏有关[29]。抗H3抗体可能有助于胰腺炎的治疗[29]。

总之，EH通过TLR信号通路、增加胞膜通透性 等机制，导致机体脑、心脏、肺脏、肝脏、肾脏、胰腺等重要器官损伤。EH水平可反映急性器官损伤的严重程度，器官损伤纠正后后，其水平随之下降。此外，EH也是治疗靶点之一[30-33]。切断组蛋白从胞内向胞外易位、中和循环中组蛋白、使用EH抗体及阻断组蛋白信号转导等措施，可能是将来治疗的新方向。