不同酶制剂对豆粕中抗原蛋白的影响

龚阿琼， 高 震， 陈敬帮， 戴晋军， 胡骏鹏， 王学东

（1.安琪酵母股份有限公司湖北省酵母功能重点实验室，湖北宜昌443003；2.武汉轻工大学农产品加工与转化湖北省重点实验室，湖北武汉430023）

随着饲料行业和畜禽养殖业的快速发展，豆粕作为大豆加工副产物，富含多种营养物质，其中蛋白质含量为40% ～50%， 脂肪为1% ～2%，碳水化合物约为10% ～15%， 且较鱼粉价格低，是目前广泛使用的植物性蛋白质饲料原料， 其需求量逐年递增（熊智辉等，2007）。然而豆粕中含有的抗原蛋白，如大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白等，会造成畜禽生产性能和饲料利用率降低， 这在一定程度上限制了其在饲料中的应用 （朱长生等，2014）。发酵法能在一定程度上去除豆粕中的有害物质或抗营养因子，提高其营养价值，但这会大幅度提高豆粕的使用成本（王章存等，2018）。随着酶制剂工业的快速发展和各种酶制剂产品的问世，为利用酶制剂解决豆粕中的抗营养因子问题提供了可能性（姜倩倩等，2012）。王之盛等（2004）的体外酶解试验表明， 蛋白酶对大豆蛋白的体外降解并不总是降低大豆蛋白生物学的致敏性， 大豆蛋白的降解具有蛋白酶特异性， 不同的蛋白酶作用于不同的大豆蛋白亚基或结构， 并最终反映到对动物的致敏性差异上（于海涛等，2018；陈乃松等，2008；王宝海等，2005）。 因此，本文使用常见的酶制剂采用单一和复合的方法对豆粕中的相应抗原蛋白开展试验，测定其中抗原蛋白的水平，旨在为利用酶制剂体外处理豆粕中的抗原蛋白提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 豆粕，购自滨州万齐饲料有限公司； 大豆球蛋白定量检测试剂盒、β-伴大豆球蛋白定量检测试剂盒， 购自北京龙科方舟生物工程技术有限公司。

碱性蛋白酶1 ～3，购自山东蔚蓝生物科技有限公司；碱性蛋白酶4 ～6，购自宁夏夏盛实业集团有限公司；碱性蛋白酶7 ～11，购自安琪酵母股份有限公司。 中性蛋白酶1 ～2，购自山东蔚蓝生物科技有限公司；中性蛋白酶3 ～5，购自安琪酵母股份有限公司。 酸性蛋白酶1 ～2，购自山东蔚蓝生物科技有限公司；酸性蛋白酶3 ～4，购自安琪酵母股份有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 酶解豆粕方法 根据饲料采样GB/T14699.1-2005 对购买豆粕进行分装采样， 在每个呼吸袋装入200 g 豆粕， 按照料水比5：4 加入一定体积蒸馏水， 在25 ℃条件下再加入0.5%的酶制剂，处理24 h 后，将呼吸袋打开，湿物料搅拌均匀取样备用，测定其中抗原蛋白含量。

1.2.2 大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的测定ELISA 测定过程参照产品说明书进行。 过程简要描述如下：称取一定质量备用样品（样品需粉碎成60 目以上颗粒，0.3 g） 于50 mL 离心管中， 加入30 mL 样品提取液，于25 ℃振荡提取16 h，静置2 min 后，离心5 min（4000 r/min），取上清液并稀释70 倍。 将样品和标准品对应微孔按序编号，每个样品和标准品平行测定两次， 记录校准孔和样品孔所在的位置，经过加样、洗板、加酶标试剂、显色，加终止液后于450/630 nm 双波下读取吸光度值。 按照下列公式计算吸光率：

式中：B 为校准品2 ～6 或样品的平均吸光度值，B0为校准品1 的平均吸光度值。

校准曲线的绘制：以校准品百分吸光率为纵坐标，以校准品浓度的对数为横坐标绘制标准曲线。

1.2.3 试验设计 采用对比试验方法，在实验室进行体外消化试验： 在恒温振荡器上进行反应（37 ℃，90 min，100 r/min），反应结束后立即瞬间高温灭活终止酶解反应，烘干后测定相关的抗营养因子。

1.2.4 数据处理 抗原蛋白降解率计算公式如下：

抗原蛋白降解率/%=（对照组豆粕与酶解豆粕的差值）/对照组豆粕×100。

2 结果与分析

2.1 酶制剂的筛选

2.1.1 碱性蛋白酶 由图1 可知， 在相同的酶解参数（料水比、温度、酶添加量和处理时间）下，不同碱性蛋白酶对豆粕中抗原蛋白的含量影响差异较大，10 号酶对两种抗原蛋白都有效果， 对大豆球蛋白降解效果更明显。

图1 不同碱性蛋白酶对豆粕中抗原蛋白的降解效果

2.1.2 中性蛋白酶 由图2 可知， 在相同的酶解参数（料水比、温度、酶添加量和处理时间）下，不同中性蛋白酶对豆粕中抗原蛋白的含量有一定差异性，5 号酶对大豆球蛋白降解效果优于伴大豆球蛋白。

图2 中性蛋白酶对豆粕中抗原蛋白的降解效果

2.1.3 酸性蛋白酶 由图3 可知，在相同的酶解参数（料水比、温度、酶添加量和处理时间）下，不同酸性蛋白酶对豆粕中抗原蛋白的含量影响差异相对不大，4 号酶对伴大豆球蛋白降解效果较好。

图3 酸性蛋白酶对豆粕中抗原蛋白的降解效果

2.2 酶添加量的选择

2.2.1 碱性蛋白酶用量 由图4 可知，在相同的酶解参数（料水比、温度和处理时间）下，随着碱性蛋白酶（10 号）量的增加，豆粕中的大豆球蛋白降解率增大， 表明在碱性蛋白酶的催化作用下，豆粕中的大豆球蛋白含量越来越低。 在0.7%添加量时达到最高降解率。

图4 不同添加量的碱性蛋白酶对大豆球蛋白的降解效果

2.2.2 中性蛋白酶用量 由图5 可知，在相同的酶解参数（料水比、温度和处理时间）下，随着中性蛋白酶（5 号）量的增加，豆粕中的大豆球蛋白降解率增大， 表明在中性蛋白酶的催化作用下，豆粕中的大豆球蛋白含量越来越低。在曲线的开始阶段，斜率最大，此后逐渐减小，表明随着中性蛋白酶量的增加，大豆球蛋白降解率的增加也逐渐减小。

图5 不同添加量的中性蛋白酶对大豆球蛋白的降解效果

2.2.3 酸性蛋白酶用量 由图6 可知，在相同的酶解参数（料水比、温度和处理时间）下，随着酸性蛋白酶（4 号）量的增加，豆粕中的β-伴大豆球蛋白降解率增大，表明在酸性蛋白酶的催化作用下，豆粕中的大豆球蛋白含量越来越低。在0.6%添加量之后逐渐减小，表明随着酸性蛋白酶量的增加，大豆球蛋白降解率的增加也逐渐减小。

图6 不同添加量的酸性蛋白酶对β-伴大豆球蛋白的降解效果

2.3 复合酶的制备 优选10 号碱性蛋白酶、5 号中性蛋白酶和4 号酸性蛋白酶按照7:5:6 比例制备复合酶。 由图7 可知，在相同的酶解参数（料水比、温度、酶添加量和处理时间）下，复合酶对抗原蛋白的降解效果优于单个酶。

图7 不同酶对豆粕中抗原蛋白的降解效果

3 结论

豆粕是畜牧行业中优质蛋白质来源之一，但豆粕中的抗原蛋白是普通存在的问题。 酶解法被认为是安全有效可降低抗原蛋白的方法， 于海涛等（2018）的试验表明，使用6 kg/t 的角蛋白酶可以降解60%的伴大豆球蛋白和37%的大豆球蛋白，本文通过筛选不同外源酶试验，也得出不同酶制剂对豆粕中抗原蛋白有不同程度的降解作用，说明酶解法确实是去除抗原蛋白的有效方法。 推测抗原蛋白类物质以复杂的连接方式形成复合体，单一的酶制剂难以充分破坏其结构，因此多种酶制剂的协同作用效果可能更好， 本文也验证了这一推测，在同样的酶解方法下，复合酶制剂对豆粕中抗原蛋白降解效果优于单一酶制剂。 通过抗原蛋白的降解率分析， 使用外源酶可有效提高豆粕中的蛋白消化利用率， 但是酶解法的酶解效果受酶的种类、 添加量、 酶解条件等多种因素的影响。王之盛等（2004）认为，还需要考虑不同酸碱性条件对酶解能力的影响， 并通过试验验证在碱性条件下有利于豆粕抗原蛋白的降解。 因此如何有效降低或者完全去除豆粕中的抗原蛋白， 还需在酶解方法上做更深入的研究。