吉林省花生秧与花生壳的体外发酵特性

郑 琳，魏炳栋，张立春，何中国，于 维，赵岭乐，王 欣

（1. 吉林省农业科学院畜牧科学分院，吉林 公主岭 136100；2. 吉林省农业科学院花生所，吉林 公主岭 136100；3. 公主岭市环保局，吉林 公主岭 136100）

随着畜牧业的不断发展，常规饲料资源的需求量已不能满足畜牧业发展的要求，饲料资源的不当处理，也造成了严重的环境问题。如何合理利用饲料资源是缓解饲料资源短缺和保护生态环境的关键[1]。羊草(Leymus chinensis)作为吉林省西部草原区的优势草种，其适口性强，具有较高的营养价值，是东北地区牧场种植的优良草种[2]。由于其产量高、质量优，也是吉林省各种草食家畜的优质干草资源[3]。花生(Arachis hypogaea)是我国重要的油料作物之一，种植面积仅次于油菜(Brassica campestris)，位居第二，花生秧与花生壳是花生收割时期产生的农业副产物[4]。花生秧作为一种优质饲料资源，国内学者分别从地区[5]、品种[6]、收获时间和高度[7-8]等方面对其进行了营养价值评定；冯豆等[9]首次利用近红外反射光谱技术快速检测花生秧的常规营养成分，该技术能够精准预测花生秧中的干物质(dry matter, DM)、粗蛋白质(crude protein, CP)及中性洗涤纤维(neutral detergent fibre,NDF)含量；黄帅等[10]和杨雪海等[11]也对不同地区的花生壳进行了营养价值评定。

羊草作为吉林省的优质饲草资源已在畜牧业中得到了广泛的应用，其营养价值方面的研究相对较多，但对于吉林省花生副产物的营养价值研究还鲜见报道。且国内关于花生副产物的营养价值评定多集中于常规营养成分分析及瘤胃降解特性等方面的研究，对于体外发酵特性方面的研究也甚少。体外产气法是评定粗饲料营养成分可利用率的一种方法，该方法可根据不同粗饲料在一定时间内产气量与产气速率的不同，来估测其有机物的消化率，与其他方法相比，重复性好、自动化程度高，得到了国内外的广泛认可[12]。

因此，本研究利用体外产气法分析花生秧、花生壳与羊草3 种粗饲料的体外发酵特性，以羊草作为对照，通过比较花生副产物与羊草各发酵参数的不同对其进行营养价值评定，以期为吉林省花生副产物的合理开发与利用提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 饲料原料的采集与处理

试验所用花生秧采于吉林省双辽地区，9 月20 日收割，品种名为“科富花2 号”；花生壳粉碎后制粒；羊草采于吉林省农业科学院畜牧科学分院。原料经采集后于65 ℃烘干制成风干样品，粉碎过1 mm 筛，密封保存以备用。3 种饲料原料的营养成分如表1 所列。

表 1 3 种粗饲料的营养成分(干物质基础)Table 1 Nutritional components of three types of roughage (DM basis)

1.2 试验动物与饲养管理

试验所选用的瘤胃液供体牛为3 头健康，年龄、体重相近的装有永久性瘤胃瘘管的草原红牛，每天于08:00 和18:00 各饲喂一次，自由采食羊草，自由饮水。

1.3 体外产气试验

1.3.1 人工瘤胃缓冲液的制备

人工瘤胃缓冲液配制参照Menke 和Steingass[13]的方法。量取520.2 mL 蒸馏水，分别加入0.1 mL A 液、208.1 mL B 液、208.1 mL C 液 和1.0 mL D 液 于1 000 mL 容量瓶中，放置过夜，临用前加入62.4 mL E 液，至于39 ℃恒温水浴中，持续冲入CO2气体，直至缓冲液由浅蓝色转变为近无色即可[14]。

1.3.2 瘤胃液的采集

试验当日晨饲前，分别从3 头供试动物的瘤胃内采集足量的瘤胃液于存有CO2气体的保温瓶中，盖严瓶口，迅速带回实验室。搅拌均匀后经尼龙布过滤，将滤液置于39 ℃恒温水浴中，并持续冲入CO2气体以确保瘤胃液处于厌氧环境。

1.3.3 试验过程

称取2 g 饲料原料于发酵罐中，置于39 ℃恒温水浴中预热30～60 min，然后加入之前配置好的缓冲液和瘤胃液，缓冲液与瘤胃液的比例为2∶1，缓冲液100 mL，瘤胃液50 mL，于39 ℃的水浴摇床中进行体外发酵，转速为80 r·min-1，每个样品5 个重复，并设定空白对照，利用Qtfxy-6 型产气装置进行体外产气量数据的采集[15]。发酵结束后将发酵液于-20 ℃保存，用于后续各项发酵参数的测定。

1.4 测定指标与方法

1.4.1 常规营养成分

3 种粗饲料的干物质(dry matter, DM)、粗蛋白质(crude protein, CP)、钙(Ca)和磷(P)的测定参照张丽英[16]的方法。中性洗涤纤维(neutral detergent fibre, NDF)和酸性洗涤纤维(acid detergent fibre,ADF)的测定参照Van Soest[17]的方法。

1.4.2 产气量及产气动力学参数

产气装置自动采集每个发酵罐每6 min 的平均产气量，通过计算获得2、4、6、8、12、24 h 各时间点的累计产气量，根据以下公式计算产气量：

式中：GPt为在t 时间点累计发酵产气量(mL·g)-1，Vt为样品罐指定时间内的累计产气量(mL)，V0为空白罐指定时间内的累计产气量(mL)，W 为样品干物质含量(g)。

产气动力学参数依据France 等[18]提出的方程进行计算，方程如下：

式中：GPt为在t 时间点累计发酵产气量(mL·g-1)，A 为 理 论 最 大 产 气 量(mL·g-1)，b 为 产 气 速 率(mL·h-1)，LAG 为体外发酵产气延滞时间(h)，t 为发酵时间(h)。

根据式(3)计算达到最大产气量1/2 时的产气速率(AGPR, mL·h-1)[19]：

1.4.3 pH

发酵结束后立即用pHS-3C 型pH 计测定各发酵液的pH。

1.4.4 氨态氮

取发酵液10 mL，5 400 r·min-1离心10 min，取上清液做适当稀释，参照冯宗慈和高民[20]改进方法，采用L9 型紫外-可见分光光度计测定吸光度值，波长700 nm，根据标准曲线及吸光度值求出发酵液的氨态氮浓度。

1.4.5 微生物蛋白

采用差速离心法分离获得细菌组分[21]。发酵结束后取发酵液50 mL 经四层纱布过滤，于1 200 r·min-1离 心15 min 去 除 原 虫 和 饲 料 大 颗 粒，将 上清液于7 630 r·min-1离心30 min，弃去上清液，用9%的生理盐水重悬菌体，清洗两次，沉淀即为细菌组分，采用凯氏定氮法测定细菌组分的微生物蛋白浓度。

1.4.6 挥发性脂肪酸

样品前处理：发酵液摇匀之后，取样加入2 mL水(1∶3 磷酸水溶液)，涡旋均浆2 min，加入2 mL乙醚萃取10 min，4 000 r·min-1离心20 min (做低温处理，放置于冰水浴中离心)；离心后取出乙醚相，再加入2 mL 乙醚萃取10 min，4 000 r·min-1离心分离，离心后再次取出乙醚相，将两次萃取液合并挥发定容至2 mL，进样分析。

用赛默飞世尔气质联用仪进行分析。色谱柱为TG WAX 30 m × 0.25 mm × 0.25 μm。升温程序：初始温度100 ℃，保留5 min，以5 ℃·min-1升温至150 ℃，再以30 ℃·min-1升温至240 ℃，保留30 min。流速1 mL·min-1，分流比75∶1，载气为氦气，进样器温度240 ℃。质谱：EI 源；轰击电压：70 eV；单离子扫描模式：定量离子60、73；离子源温度：200 ℃；连接线温度：250 ℃。

1.5 数据统计分析

3 种粗饲料不同时间点的体外产气量和体外发酵数据先经Excel 2007 进行初步整理，然后利用SPSS 19.0 统计软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)和显著性检验，采用Duncan 氏法对数据进行多重比较，试验结果用平均值 ± 标准误表示，差异显著的判定标准为P＜0.05；通过SAS 9.1软件的NON-LINEAR 方法计算产气动力学参数。

2 结果与分析

2.1 3 种粗饲料的体外发酵产气量及产气动力学参数

3 种粗饲料在不同时间点的累计产气量和达到最大产气量1/2 时的产气速率结果一致，为花生秧 ＞ 花生壳 ＞ 羊草，三者之间差异显著(P＜0.05)；花生秧的理论最大产气量显著高于花生壳和羊草(P ＜0.05)，花生壳与羊草之间差异不显著(P ＞ 0.05)；羊草的产气速率和产气延滞时间显著高于花生秧和花生壳，三者之间差异显著(P＜0.05) (表2)。

表 2 3 种粗饲料不同时间点产气量及产气动力学参数Table 2 GP at different time points and kinetic parameters of three types of roughage

2.2 3 种粗饲料体外发酵24 h 的pH 及挥发性脂肪酸含量

体外发酵24 h 后，3 种粗饲料的pH 为羊草最高，花生秧最低，三者之间差异显著(P ＜0.05)；乙酸比例无显著性差异(P ＞ 0.05)；丙酸的比例为花生秧最高，其次是花生壳，羊草最低，三者之间差异显著(P＜0.05)；丁酸的比例为羊草最高，其次是花生壳，花生秧最低，三者之间差异显著(P＜0.05)；总挥发性脂肪酸含量为花生秧最高，且显著高于花生壳和羊草(P＜0.05)，花生壳与羊草之间差异不显著(P ＞ 0.05)；乙酸/丙酸的值为羊草最高，且显著高于花生秧和花生壳(P＜0.05)，花生秧与花生壳之间差异不显著(P ＞ 0.05) (表3)。

2.3 3 种粗饲料体外发酵24 h 的氨态氮浓度及微生物蛋白含量

氨态氮浓度为羊草最高，且显著高于花生秧和花生壳(P＜0.05)，花生秧与花生壳之间差异不显著(P ＞ 0.05)。微生物蛋白含量为花生秧最高，羊草最低，三者之间差异显著(P＜0.05) (表4)。

3 讨论

3.1 不同粗饲料对体外产气量及产气动力学参数的影响

体外发酵期间产生的气体主要包括瘤胃微生物发酵底物产生的二氧化碳、甲烷及挥发性脂肪酸经缓冲作用生成的二氧化碳[22]。累计产气量的高低一定程度上反映了瘤胃微生物对发酵底物的利用程度和瘤胃微生物的自身活性[23]。汤少勋等[24]研究发现，不同品种秸秆在各时间点的产气量与NDF、ADF 含量呈显著负相关关系，本研究中3 种粗饲料在各时间点的产气量由高到低为花生秧 ＞ 花生壳 ＞ 羊草，其各自的NDF 含量大小为花生壳 ＞ 羊草 ＞ 花生秧，其产气量与NDF 含量趋势相反，与前人研究结果一致。花生壳的产气量低是由于木质素含量高，不易被消化利用。黄帅等[10]利用康奈尔净碳水化合物-蛋白质体系(Cornell Net Carbohy drate and Protein System, CNCPS)计算得出花生壳不可利用的细胞壁含量高达47.94%，进一步说明了花生壳不易被微生物利用。

本研究中3 种粗饲料的理论最大产气量由高到低为花生秧 ＞ 花生壳 ＞ 羊草，可能与3 种粗饲料营养成分的不同有关，有研究报道[25]，理论最大产气量的高低与粗饲料中可溶性非结构碳水化合物与粗蛋白比例正相关。

3.2 不同粗饲料对pH 及挥发性脂肪酸的影响

pH 能够直观地反映瘤胃的发酵状况，同时也是反映瘤胃内VFA 酸度的重要指标。正常情况下反刍动物瘤胃液的pH 变化范围为5.5～7.5，当pH低于6.5 时，纤维物质的消化受到影响，当pH 低于5.5 时，则会引起酸中毒[26]。本研究中，3 种粗饲料的体外发酵液pH 在6.67～7.23，均在正常变化范围之内，且不会影响对纤维物质的消化。挥发性脂肪酸是饲料中碳水化合物经厌氧发酵的终产物，为反刍动物提供总能量的70%～80%，是维持动物自身生命活动的主要能源。瘤胃内pH 的高低与TVFA 的含量有关，TVFA 含量的增加会降低瘤胃液的pH，本研究中3 种粗饲料的pH 和TVFA的变化趋势相反。其中花生秧的TVFA 含量和丙酸比例显著高于花生壳和羊草，乙酸/丙酸比值最低；羊草的TVFA 含量和丙酸比例显著低于花生秧和花生壳，乙酸/丙酸比值显著高于花生秧和花生壳，其原因可能与饲料中碳水化合物的组成不同有关，非结构碳水化合物(nonstructural carbohydrate，NSC)含量的增加会加快瘤胃的发酵速率，使其产生更多的VFA，其发酵类型为丙酸型发酵，乙酸/丙酸的比值会降低[27]，黄帅等[10]计算得出花生秧的NSC 为76.86%，而羊草的NSC 仅为14.01%。研究表明，不同类型日粮对VFA 的浓度和比例有较大影响，其总量在60～150 mmol·L-1，单个酸之间的比例范围为乙酸(40%～75%)∶丙酸(15%～40%)∶丁酸(10%～20%)[28]。本研究中，3 种粗饲料的TVFA 含量范围为15.18～24.33 mmol·L-1，乙酸比例为46%左右，丙酸比例为23%～28%，丁酸比例为20%～25%。TVFA 含量偏低，可能与供试动物对营养物质的消化吸收有关；丁酸比例偏高，其原因可能是瘤胃微生物的种群差异所造成的，瘤胃中原虫有利于丁酸的产生，其研究报道称祛除原虫可将瘤胃的发酵类型从丁酸型发酵向丙酸型发酵转变。

表 3 3 种粗饲料体外发酵24 h 的pH 及VFA 含量Table 3 pH and VFA content of three types of roughage after 24 h of in vitro fermentation

表 4 3 种粗饲料体外发酵24 h 的氨态氮浓度及微生物蛋白含量Table 4 Ammonia nitrogen concentration and microbial protein content of three types of roughage after 24 h of in vitro fermentation

3.3 不同粗饲料对瘤胃体外发酵氨态氮浓度和微生物蛋白含量的影响

瘤胃内氨态氮浓度和微生物蛋白含量是研究瘤胃发酵的重要指标。氨态氮浓度可以综合反映饲料中蛋白质降解与瘤胃中微生物蛋白合成之间的平衡。瘤胃微生物生长的最佳氨态氮浓度为6～9 mg·dL-1，过高或过低都不利于微生物蛋白的合成。本研究中，3 种粗饲料的氨态氮浓度范围为6.83～12.09 mg·dL-1。羊草的氨态氮浓度过高，不利于微生物的生长。MCP 的合成离不开氨态氮，瘤胃内适宜的能氮比例会促进MCP 的合成。3 种粗饲料中花生秧的氨态氮浓度和MCP 含量均高于花生壳，说明微生物对其合成MCP 的利用率较高。羊草的氨态氮浓度最高，但MCP 含量最低，可能是瘤胃内降解产生的氨超过了最适范围，过量的氨不能被微生物充分利用，从而降低了MCP的合成量。

4 结论

体外发酵24 h 后，花生秧的体外产气量、TVFA、丙酸比例及MCP 含量显著高于花生壳和羊草，pH 显著低于花生壳和羊草。羊草的丁酸比例、乙酸/丙酸值及氨态氮浓度显著高于花生秧和花生壳。综合各项指标发现，花生秧的体外发酵效果最好，更易被瘤胃微生物利用；花生壳的纤维木质化程度高，对其进行预处理，如粉碎、氨化、青贮等可提升其营养价值。