海藻酸钠-聚乙烯醇复合固定醋酸菌研究

赵群，李静，窦召语，代静静，谭海刚

(青岛农业大学 食品科学与工程学院，山东 青岛 266109)

固定化细胞技术具有高细胞密度、容易分离、可重复使用和连续化生产的优点[1-3]，其载体大概分为有机载体、无机载体和复合载体三类[4-6]。与传统发酵相比，固定化细胞发酵避免了细胞与水溶液难以分离、存在二次污染等问题，在食品行业应用前景广阔[7,8]。王岩[9]使用SA和CaCl2对醋酸菌进行固定化，应用于香芋醋的酿制研究。Dias等[10]以SA和CaCl2对醋酸杆菌和葡萄糖酸杆菌进行固定化，制作了含有高含量有机酸和挥发性化合物的嘉宝果醋。

由于传统固定化技术容易导致细胞活性丧失或机械强度较差，因此越来越多的学者将目光投向了新型复合载体固定化技术[11]。本研究以SA、PVA为固定化材料对醋酸菌进行复合固定化，以机械强度、硬度、包埋率、产酸量为指标优化固定化条件，旨在选择适合醋酸菌的固定化载体和工艺，从而提高醋酸菌的产酸量和产酸稳定性。

1 材料与方法

1.1 主要试验材料

醋酸菌：青岛农业大学食品发酵与酿酒工程实验室保藏；海藻酸钠：国药集团化学试剂有限公司；聚乙烯醇(聚合度1750±50)：天津市巴斯夫化工有限公司；氯化钙：天津市福晨化学试剂厂。

1.2 主要仪器设备

TA.XT Plus物性测试仪 北京微讯超技仪器技术有限公司；ZQPZ-228全温振荡培养箱 天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司。

1.3 培养基

种子培养基：2%葡萄糖，1%酵母浸粉，pH 6.0，灭菌后加3%无水乙醇。

发酵培养基：2%葡萄糖，1%酵母浸粉，pH 6.0，灭菌后加5%无水乙醇。

1.4 试验方法

1.4.1 醋酸菌的制备

醋酸菌在种子培养基30 ℃、170 r/min培养24 h后于4 ℃、3000 r/min离心15 min收集菌体，用磷酸缓冲液(0.2 mol/L、pH 6.0)洗涤2次，制成20 mg/mL菌悬液。

1.4.2 醋酸菌SA-PVA复合固定化颗粒制备

将醋酸菌悬液与SA(4%)-PVA(10%)溶液(9∶1)以1∶1的比例混合，用1 mL注射器缓慢滴入含0.6% CaCl2的饱和硼酸溶液中，静置固定1.5 h，无菌水洗涤2次，待用。

1.4.3 SA-PVA复合固定化条件的优化

1.4.3.1 SA浓度对醋酸菌固定化颗粒的影响

在10% PVA中分别添加1%、2%、3%、4%、5%的SA，制成醋酸菌固定化颗粒，测定其硬度、机械强度、产酸量和包埋率，确定较佳的SA浓度。

1.4.3.2 PVA浓度对醋酸菌固定化颗粒的影响

在4% SA中分别添加4%、6%、8%、10%、12%的PVA，制成醋酸菌固定化颗粒，测定其硬度、机械强度、产酸量和包埋率，确定较佳的PVA浓度。

1.4.3.3 CaCl2浓度对醋酸菌固定化颗粒的影响

分别采用0.1%、0.3%、0.6%、0.9%、1.2%的CaCl2制成醋酸菌固定化颗粒，测定其硬度、机械强度、产酸量和包埋率，确定较佳的CaCl2浓度。

1.4.4 正交试验

通过单因素试验确定有机载体SA、PVA和固定液中CaCl2的较佳浓度，根据表1 L9(33)因素水平表，进行正交试验并分析，最后对最优试验进行验证。

表1 正交试验因素水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal test %

1.5 分析方法

1.5.1 醋酸菌固定化颗粒硬度的测定

使用TA.XT Plus物性测试仪，根据伍悦等[12]的方法稍作修改，选取7颗大小均匀的颗粒置于测试台上，选用 P36R探头，测试速度为1 mm/s 。

1.5.2 醋酸菌固定化颗粒机械强度的测定

挑选70颗大小均匀的颗粒放入250 mL三角瓶中，加7颗玻璃珠、40 mL蒸馏水，置于摇床振荡15 h。计算完好的醋酸菌固定化颗粒数目(n)。

机械强度=n÷70×100%。

1.5.3 醋酸菌固定化颗粒包埋率的测定

根据肖雨等[13]采用的平板计数法。

1.5.4 醋酸菌固定化颗粒产酸量的测定

根据朱传柳等[14]的滴定法稍作修改测定产酸量。取发酵液2 mL于三角瓶中，加入蒸馏水3 mL，以酚酞为指示剂，用0.2 mol/L的NaOH溶液将其滴定至粉红色，记录NaOH溶液消耗的体积(VNaOH)，计算总酸含量(以乙酸计，g/dL)=VNaOH×0.6。

2 结果与分析

2.1 SA-PVA复合固定化条件的优化

2.1.1 SA浓度对醋酸菌固定化效果的影响

图1 SA浓度对醋酸菌固定化颗粒的硬度及机械强度的影响Fig.1 Effect of SA concentration on the hardness andmechanical strength of the immobilized particlesof acetic acid bacteria

图2 SA浓度对醋酸菌固定化颗粒的包埋率及产酸量的影响Fig.2 Effect of SA concentration on the embedding rate and acid yield of the immobilized particles ofacetic acid bacteria

由图1和图2可知，随着SA浓度的不断提高，醋酸菌固定化颗粒的硬度不断增大，机械强度、包埋率和产酸量则呈现先升高后降低的趋势。4% SA制备的固定化颗粒机械强度、包埋率和产酸量分别为100%、(86.60±4.56)%和(3.13±0.15) g/dL，分别比1% SA固定化颗粒高了4倍、0.13倍和0.29倍，其颗粒硬度为(2512.86±154.13) g，较5% SA颗粒硬度小，但达到使用要求。故确定SA的最佳浓度为4%。

2.1.2 PVA浓度对醋酸菌固定化效果的影响

图3 PVA浓度对醋酸菌固定化颗粒的硬度及机械强度的影响Fig.3 Effect of PVA concentration on the hardness and mechanical strength of the immobilizedparticles of acetic acid bacteria

图4 PVA浓度对醋酸菌固定化颗粒的包埋率及产酸量的影响Fig.4 Effect of PVA concentration on the embeddingrate and acid yield of the immobilized particlesof acetic acid bacteria

由图3和图4可知，PVA浓度对醋酸菌固定化颗粒的硬度、机械强度、包埋率和产酸量的影响相对较小，总体上呈现先升高后降低的趋势。当PVA浓度为10%时，固定化颗粒效果最好，其硬度为(2512.018±54.96) g，机械强度为100%，包埋率为(86.09±3.83)%，产酸量为(3.12±0.24) g/dL。因此，选取10%为PVA的最佳浓度。

2.1.3 CaCl2浓度对醋酸菌固定化效果的影响

图5 CaCl2浓度对醋酸菌固定化颗粒的硬度及机械强度的影响Fig.5 Effect of CaCl2 concentration on the hardness and mechanical strength of the immobilized particles of acetic acid bacteria

图6 CaCl2浓度对醋酸菌固定化颗粒的包埋率及产酸量的影响Fig.6 Effect of CaCl2 concentration on the embeddingrate and acid yield of the immobilized particlesof acetic acid bacteria

由图5和图6可知，随着CaCl2浓度从0.1%增加到0.6%时，固定化颗粒的机械强度受到的影响较小，但其硬度、包埋率和产酸量有显著提高，CaCl2浓度大于0.6%后均有所下降。因此，0.6%为CaCl2最合适的浓度。此时，固定化颗粒硬度达到(2515.96±55.51) g，机械强度为100%，包埋率为(86.09±3.08)%，产酸量为(3.15±0.17) g/dL，分别是0.1% CaCl2浓度制备颗粒的5.99倍、1.05倍、1.52倍和2.00倍。

2.2 正交试验

以产酸量为测定指标，对SA浓度、PVA浓度和CaCl2浓度进行正交试验，正交试验设计与结果见表2。

表2 正交试验结果与分析Table 2 Orthogonal test results and analysis

续 表

由表2可知，SA、PVA和CaCl2浓度3个因素的极差R值分别为0.021，0.1523，0.0653，RB>RC>RA，即3个因素中PVA浓度对醋酸菌固定化颗粒产酸量的影响最大，CaCl2浓度的影响次之，SA浓度的影响最小。其中醋酸菌固定化最佳条件为A2B2C2，即最佳固定条件为4% SA、10% PVA、0.6% CaCl2。

2.3 SA-PVA复合固定化最优试验

以正交试验的最优条件4% SA、10% PVA、0.6% CaCl2对醋酸菌进行固定化，见图7和表3。

图7 醋酸菌SA-PVA复合固定化颗粒Fig.7 Acetic acid bacteria SA-PVA composite immobilized particles

表3 SA-PVA复合固定化最优试验Table 3 The optimum test of composite immobilization of SA-PVA

测定其颗粒粒径在2.2 mm左右，其硬度为(2511.87±33.43) g，机械强度为100%，包埋率为(86.09±0.81)%，产酸量达到(3.13±0.09) g/dL，较游离醋酸菌的产酸量(2.63±0.13) g/dL提高了16.01%。

3 结论

本试验以SA和PVA对醋酸菌进行复合固定化，并以SA浓度、PVA浓度和CaCl2浓度对醋酸菌复合固定化条件进行单因素试验及正交试验分析，最终确定醋酸菌最佳固定化条件为4% SA、10% PVA、0.6% CaCl2。在此条件下，固定化颗粒粒径在2.2 mm左右，硬度为(2511.87±33.43) g，机械强度为100%，包埋率为(86.09±0.81)%，产酸量达到(3.13±0.09) g/dL，较游离醋酸菌提高了16.01%。