电针肾俞、足三里联合滋肾强骨汤对去卵巢骨质疏松大鼠骨组织和血清GH/IGF-1系统的影响*

魏科祥，张 璇，曹 华

(1.西安市第一医院，陕西 西安 710002； 2.咸宁市中心医院，湖北 咸宁 437100)

随着我国经济社会的快速发展和人口结构的老龄化，骨质疏松的患病率日益升高，流行病学研究表明，在我国50岁以上人群中骨质疏松的患病率为 ：女性20.7%，男性14.4%[1]。骨质疏松是一种全身骨代谢性疾病，其主要特征是骨量减少及骨微结构改变，伴随骨强度下降、骨脆性增加及骨折危险性增加等[2],其中绝经后骨质疏松是女性常见病，严重危害中老年妇女的健康，并影响其生活质量[3]。在我国传统医学中，骨质疏松属于“骨痿”“骨痹”范畴，绝经后骨质疏松根源于肾，病在骨，肝肾亏虚、筋骨失养，骨枯髓减，发为骨痿[4]。本研究采用电针肾俞、足三里联合滋肾强骨汤来考察该治疗方法对去卵巢所致骨质疏松大鼠骨密度的影响，并通过其对骨组织和血清GH/IGF-1系统的影响初步探讨其作用机制，以期为该联合疗法在临床的更广泛应用提供基础实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康雌性Wistar大鼠30只，4～6月龄，体质量(200±20)g，清洁级，由湖北省实验动物研究中心提供，许可证号 ：SCXK(鄂)2015-0018。

1.1.2 试剂与仪器 华佗牌电针仪(型号 ：SDZ-II，广东省普宁市普慈医疗器械有限公司)；双能X射线骨密度仪(型号 ：InAlyzer，韩国)；酶标分析仪(型号 ：DNM-9606，北京普朗医疗技术有限公司)；大鼠(GHR)Elisa试剂盒(SY-R305，上海双赢生物科技有限公司)；大鼠(IGF-1)Elisa试剂盒(SBJ-R0761，南京森贝伽生物科技有限公司)；大鼠(IGF-1R)Elisa试剂盒(GOY-SJH205，上海谷研生物科技有限公司)。

1.1.3 实验药物 滋肾强骨汤由熟地黄、人参、山萸肉、茯苓、山药、黄芪、丹皮、杜仲、怀牛膝、桑寄生、菟丝子、续断和甘草配伍组成。具有健脾益气、补肾强骨之功效。

1.2 分组及模型复制

大鼠在实验条件下饲养1周，以适应环境减少应激。将实验大鼠按照体质量区组化随机分为假手术组、模型组和治疗组，每组10只。模型组和治疗组大鼠腹腔注射戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉，仰位固定。剪开腹部皮肤、钝性剥离肌肉层，结扎并切除双侧卵巢，缝合肌肉层及毛皮层[5]。术后腹腔注射青霉素抗菌治疗1周后，恢复14天。假手术组大鼠不结扎和切除双侧卵巢，其他手术操作过程与模型组和治疗组相同。自双侧卵巢摘除手术后第4天起，逐只大鼠检查阴道涂片，连续5天，以不出现角化细胞作为卵巢摘除手术成功的标志。

1.3 实验方法

治疗组在大鼠恢复14天后开始接受电针肾俞、足三里联合滋肾强骨汤进行治疗。针刺穴位定位参照《实验针灸学》[6](李忠仁主编)。选用华佗牌0.35 mm×25 mm毫针，肾俞、足三里平刺4～5 mm，选用SDZ-II型电针治疗仪，刺激频率设置为50次/s，刺激强度调整至大鼠针刺穴位局部肌肉轻微抽动，并保持安静，10 min/次。每次电针结束后灌胃给药滋肾强骨汤(浓度0.4 g/mL，给药剂量1.25 mL/100 g体重)，每天早晚各1次，连续治疗12周。假手术组和模型组大鼠每天2次灌胃等体积的生理盐水。

1.4 指标检测

治疗12周后，采用双能X射线骨密度仪测定各组大鼠右侧下肢胫骨骨密度。尾静脉采血1 mL，静置15 min后，3 000 r/min，离心10 min，取上层清液-20℃冷冻保存待测。取大鼠胫骨骨组织样本，超微粉碎研磨后制备骨组织匀浆液，采用Elisa法测定骨组织和血清中GHR、IGF-1、IGF-1R蛋白水平。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 电针联合滋肾强骨汤对去卵巢骨质疏松大鼠胫骨骨密度的影响

结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠右侧下肢胫骨骨密度均明显降低(P<0.05)；与模型组相比，治疗组大鼠胫骨骨密度显著升高(P<0.05)，表明电针肾俞、足三里联合滋肾强骨汤可以升高去卵巢所致骨质疏松大鼠的骨密度。见表1。

表1 电针联合滋肾强骨汤对去卵巢骨质疏松大鼠胫骨骨密度的影响

注:与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

2.2 电针联合滋肾强骨汤对去卵巢骨质疏松大鼠骨组织中GHR、IGF-1和IGF-1R的影响

结果显示，与假手术组相比，模型组大鼠骨组织中GHR、IGF-1、IGF-1R含量显著降低(P<0.05)；与模型组比较，治疗组大鼠骨组织中GHR、IGF-1、IGF-1R含量明显升高(P<0.05)。见表2。

表2 电针联合滋肾强骨汤对骨质疏松大鼠骨组织中GHR、IGF-1和IGF-1R的影响

注:与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

2.3 电针联合滋肾强骨汤对去卵巢骨质疏松大鼠血清中GHR、IGF-1和IGF-1R的影响

结果显示，与假手术组相比，模型组大鼠血清中IGF-1、IGF-1R显著下降(P<0.05)，GHR虽有下降的趋势，但无统计学意义(P>0.05)；与模型组相比，治疗组大鼠血清中IGF-1R水平显著提高(P<0.05)，但GHR和IGF-1水平变化不明显(P>0.05)。见表3。

表3 电针联合滋肾强骨汤对骨质疏松大鼠血清中GHR、IGF-1和IGF-1R的影响

注:与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

3 讨论

绝经后骨质疏松是妇女发生骨折的首要影响因素，绝经后雌激素尤其是雌二醇水平的断崖式下跌是骨质疏松发生的主要原因[7-8]。目前临床上西医对绝经后骨质疏松主要以雌激素的替代治疗[9]和抑制骨吸收的口服双磷酸盐药物治疗[10]为主，但激素替代治疗常会伴随一些不良反应的发生，并存在乳腺以及子宫内膜肿瘤的安全隐患[11]；而口服双磷酸盐药物会有一些胃肠道反应，如食管溃疡、胃酸倒流、呕吐等[12]限制了其临床的应用。

中医学治疗绝经后骨质疏松疗效独特，常采用益肾填精、疏肝解郁、补益脾胃、活血化瘀等治疗原则[13]。其中，肾俞、足三里是临床用于骨质疏松症治疗较多的针灸穴位，肾俞穴归属足太阳膀胱经，有补肾助阳、调节生殖功能，缓解腰痛等功效；足三里穴属足阳明胃经，具有生发胃气、燥化脾湿的功效，主治胃肠病证，下肢痿痹[6]。滋肾强骨汤为院内经方，临床治疗骨质疏松症多年，疗效显著，方中熟地黄为君药，滋补肾阴、填精益髓；山药为臣药，养脾阴、护肾精；山萸肉固涩收敛，可防肾精外泄；牡丹皮泄火，可制山萸之温涩；茯苓健脾健运；杜仲、续断、怀牛膝、菟丝子、桑寄生均有补益肝肾、强筋健骨之力，黄芪与人参补气益脾、巩固气血生化，合为佐药；甘草调和诸药，为佐使;诸药配伍，共奏健脾益气、补肾壮骨之效。基于以上，本研究从GH/IGF-1系统角度探讨针刺电针肾俞、足三里联合滋肾强骨汤治疗骨质疏松的作用机制。

生长激素(Growth hormone,GH)是由脑垂体分泌的多肽类蛋白，具有促进骨骼生长的作用。GH发挥作用依赖于其受体(Growth Hormone Receptor，GHR)，GHR主要存在于脂肪组织、肠道、肾脏、肝脏、肺、心脏、胰腺和骨等组织中[14]。实验研究结果显示，GHR同时存在于成骨细胞和破骨细胞的表面，GH不但可以促进成骨细胞的增殖和分化，而且还可激活破骨细胞，通过增加破骨细胞的聚集而促进其分化，进而调节骨吸收[15]。

同时在体内，GH也可以通过胰岛素样生长因子-1(Insulin-like Growth Factor-1，IGF-1)发挥对骨组织的作用[16]。IGF-1主要由GH刺激肝脏分泌，其介导了GH在体内的大部分生物功能，如促进骨骼生长等[17]。IGF-1通过激活经典的MARK信号通路来发挥对骨代谢的作用。成骨、破骨细胞同样存在IGF-1的受体(IGF-1R)，IGF-1可增强成骨细胞的活性并增加成骨细胞的数量[18]。RANKL是破骨细胞形成标志物，文献报道IGF-1可以通过降低RANKL的水平来降低破骨细胞的形成[19]。另外，研究表明，多种内源性激素包括甲状腺激素、性激素、甲状旁腺素、糖皮质激素等都影响体内骨代谢的动态平衡。GH/IGF-1系统还可以通过对以上相关内源性激素分泌的影响来间接调控骨代谢[20]。

总体而言，GH/IGF-1轴的功能对维持体内骨量平衡的意义重大。本研究实验结果表明，电针肾俞、足三里联合滋肾强骨汤可以明显增加去卵巢大鼠的骨密度，并部分恢复骨组织和血清中GH/IGF-1系统的动态平衡。