基于均匀设计和逐步回归的热纤梭菌发酵产糖的培养基优化研究

朱新术，赵文慧，张苗，杨学艺，陈曦，胡秀秀

（1.江苏护理职业学院医学技术学院，江苏淮安 223005；2.江苏护理职业学院医学基础部，江苏淮安 223005）

热纤梭菌是一类能够特异降解木质纤维素的高温厌氧菌[1]，目前大多数学者集中于利用热纤梭菌产乙醇研究[2]，直接利用该菌发酵滤纸进行产葡萄糖和纤维寡糖的研究并不多见[3]。葡萄糖在发酵工业、畜牧业和食品工业中有重要应用。在动物保健领域，纤维寡糖和益生菌复合制剂，主要用于改善热应激肉鸡肠道功能[4]和氮排放研究[5]，并能改善断奶仔猪腹泻情况和提高饲料利用率[6]等。

实验室前期已用热纤梭菌常规培养基GS-2 进行了发酵滤纸产葡萄糖和可溶性总糖研究，但糖得率和滤纸转化率并不高。本文首先分别利用均匀设计，得到GS-2 培养基中对产糖影响较大的7 个因素及其取值范围，接着通过逐步回归建立培养基成分和优化目标间的二次多项式回归模型，并用Matlab 软件包优化工具箱中的fmincon函数在培养基成分的取值范围内求取回归模型的最优解和最优值。最后实验验证方程程的有效性，并用HPLC 分析纤维寡糖的成分。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

热纤梭菌ATCC 35609 野生株，由美国Oklahoma 大学周集中教授馈赠；酵母粉，分析纯，英国OXOID 公司；纤维寡糖标准品购自国药集团化学试剂有限公司；其他试剂均为市售国产分析纯级。

0.22μm 滤膜，Millipore；普通紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；SBA-40E 双通道生物传感分析仪，山东省科学院生物研究所；高速离心机（Neofuge 23R），上海力申科学仪器有限公司；高效液相色谱仪Waters1525。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基配制

种子培养基为GS-2 培养基（g/L），KH2PO41.5；K2HPO4·3H2O 3.8；尿素2.1；MgCl2·6H2O 1.0；CaCl2·2H2O 0.15；FeSO4·7H2O 0.00125；半胱氨酸盐酸盐1.0；纤维二糖5.0；morpholinopropane sulfonic acid(MOPS)10.0；酵母粉6.0；Na3C6HO7·2H2O 3；氧化还原指示剂刃天青0.002；初始pH 7.4。

发酵培养基由滤纸（剪成0.5-4cm）、酵母粉、氯化镁、半胱氨酸、尿素、硫酸亚铁、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氯化钙构成，其中滤纸浓度为20g/L，刃天青0.002g/L 和FeSO4·7H2O 0.00125g/L，其余成分具体配比见表1，初始pH 8.0±0.02。

1.2 培养条件

热纤梭菌种子60℃培养1d。然后以4%（v/v）接种量接种到发酵培养基中，60℃培养8d。均用100 mL 厌氧瓶，装液量为40 mL 进行培养。

1.3 测试方法

1.3.1 葡萄糖测定方法

发酵液10,000rpm,4℃离心5min，取上清液，然后用0.22μm 滤膜过滤，滤液稀释到一定倍数，使葡萄糖浓度在1g/L 以下，并用生物传感器测定葡萄糖的浓度。

1.3.2 可溶性总糖测定方法

采用蒽酮-硫酸法[7]测定滤液中可溶性总糖的浓度。

1.3.3 纤维寡糖含量测定

用HPLC 法测定滤液中纤维寡糖的浓度[8]。

1.4 试验设计

本实验选取发酵培养基中酵母粉、氯化镁、半胱氨酸盐酸盐、K2HPO4、KH2PO4、尿素和氯化钙进行均匀设计优化试验，其余成分保持为初始培养基中的浓度状态。参考《均匀设计与均匀设计表》[9]，选用U10*(108)均匀设计表安排7 因素10 水平的优化实验（表1），并把初始培养基作为对照，同时进行发酵实验。

1.6 数据分析

所有配方均进行三组平行实验，结果以均值±标准误为准。均匀设计实验中培养基成分和葡萄糖与可溶性糖之间的二次多项式回归模型建立通过MATLAB 软件包(R2018b,Mathworks,USA)逐步回归函数stepwise 实施；葡萄糖和可溶性总糖的二次多项式回归模型在自变量的取值范围内，利用MATLAB 优化工具箱中的fmincon 函数求取培养基最佳组合和相应的优化目标最佳预测值。

表1 均匀设计U10(*108)实验

2 结果与分析

2.1 均匀设计实验发酵结果

表2 葡萄糖与可溶性总糖回归模型效果

利用表2 中的发酵培养基配方进行发酵实验后，测得每种培养基组合相应的葡萄糖与可溶性总糖的浓度。易知葡萄糖浓度为1 号实验和9 号实验获得，分别为7.75 g/L 和12.33 g/L，比优化前的对照初始培养基的6.63 g/L 和9.78 g/L，分别提高了16.89%和26.07%倍。

2.2 基于逐步回归函数stepwise 的回归建模

表3 葡萄糖与可溶性总糖二次多项式回归系数显著性检验

利用MATLAB R2018b 软件包逐步回归函数stepwise 建立培养基成分与发酵液中葡萄糖浓度与可溶性总糖浓度的二次多项式回归模型（表3）

两个方程的回归系数显著性检验表明：本试验所选用的二次多项模型是极显著性的(P＜0.01)，决定系数R2均为0.999，表明此模型拟合优度好，分别仅有约1%的变异不能由模型解释。此外，除了小部分模型项之外（如X22），绝大部分模型项具有显著性(P＜0.05)，并且均匀设计葡萄糖与可溶性总糖的实验值和预测值的相对误差均不超过2%（表2），由此充分说明采用二次多项式回归模型对发酵液葡萄糖和可溶性总糖浓度进行预测的可行性和有效性。

2.2.4 模型求解与验证

利用MATLAB 优化工具箱中的fmincon 函数求取葡萄糖和可溶性总糖的二次多项式回归方程在自变量的取值范围内的培养基最佳组合和相应的优化目标最佳预测值，结果发现：产葡萄糖的最佳培养基为（g/L）：酵母粉（X1），5.379；MgCl2·6H2O（X2），0.424；半胱氨酸盐酸盐（X3），0.996；K2HPO4·3H2O（X4），7.99；KH2PO4（X5），4.991；尿素（X6），1.171 和CaCl2·2H2O（X7），0.072，相应优化目标最佳预测值为8.559 g/L。产可溶性总糖的最佳培养基为（g/L）：酵母粉（X1），3.5；MgCl2·6H2O（X2），2.0；半胱氨酸盐 酸 盐（X3），0.788；K2HPO4·3H2O（X4），8.0；KH2PO4（X5），1.4；尿素（X6），4.0 和CaCl2·2H2O（X7），0.05，相应的优化目标最佳预测值为15.899 g/L。

在上述条件下进行发酵验证，得出葡萄糖和可溶性总糖的浓度分别为9.00±1.05 g/L 和15.452±1.81 g/L，因此实验值与预测值的误差分别为5.15%和-2.89%，分别比均匀设计最高结果的7.75±0.87（即表2 中第1 号实验）和12.332±1.39（即表2 中第9 号实验）分别提高了16.13%和25.32%，比初始对照培养基的6.63±1.09 和9.78±1.02 分别提高了35.75%和58.0%。可见该模型能较好地预测实际发酵情况。且最优化条件下，热纤梭菌发酵滤纸（20g/L），葡萄糖和可溶性总糖的得率分别为45%和77.26%。

2.3.5 可溶性总糖中纤维寡糖的HPLC 分析

在可溶性总糖最佳培养基验证时，可溶性总糖浓度为15.452 g/L，测得葡萄糖含量为6.46 g/L，且用HPLC 测得纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖和纤维五糖的浓度分别为3.172g/L、2.816g/L、1.593g/L 和1.162g/L，由于纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖和纤维五糖的摩尔分子量分别为342.3、504.4、666.6 和828.7，因此热纤梭菌发酵滤纸产生的寡糖相应的摩尔比率大致为9:5:2:1，也就是纤维寡糖产物，大部分为纤维二糖和纤维三糖。

3 结论

本文通过均匀设计和基于逐步回归的二次多项式建模研究，优化了热纤梭菌ATCC35609 发酵滤纸产葡萄糖和可溶性总糖的最佳培养基分别为（g/L）：酵母粉，5.379；MgCl2·6H2O，0.424；半胱氨酸盐酸 盐，0.996；K2HPO4·3H2O，7.99；KH2PO4，4.991；尿素，1.171；CaCl2·2H2O，0.072 和酵母粉，3.5；MgCl2·6H2O，2.0；半胱氨酸盐酸盐，0.788；K2HPO4·3H2O，8.0；KH2PO4，1.4；尿素，4.0；CaCl2·2H2O，0.05。结果不仅使滤纸的产葡萄糖和可溶性总糖的产率分别高达9.00 g/L 和15.452 g/L，且得率分别为45%和77.26%。还通过HPLC分析表明热纤梭菌发酵滤纸产生的寡糖相应的摩尔比率大致为 9:5:2:1，且大部分为纤维二糖和纤维三糖，从而为利用热纤梭菌发酵纤维素产纤维寡糖以开发相应的饲料添加剂奠定了实践基础。