脊髓损伤急性期IL-6的表达及其动态变化

张晔 李媛 史文心 周郦楠

【摘要】 目的 探讨脊髓损伤（SCI）急性期不同时间点白细胞介素-6（IL-6）表达的动态变化及其意义， 为SCI的治疗提供理论依据。方法 120只Wistar大鼠， 随机分成正常对照组（8只）、Sham组（56只）、SCI组（56只）， Sham组和SCI组分别于术后0、2、4、8、12、24、48 h取材。正常对照组大鼠未进行手术操作， Sham组只咬除棘突并且不损伤脊髓， SCI组采用改良Allen s撞击法制备大鼠急性SCI模型， 比较三组大鼠不同时间点的行为学评分法（BBB）评分及脊髓组织中IL-6的表达。结果 SCI组大鼠术后BBB评分均低于正常对照组及Sham组， 差异具有统計学意义（P<0.01）;且术后48 h BBB评分高于术后4 h， 差异具有统计学意义（P<0.05）。SCI组大鼠术后各时间点大鼠脊髓组织中IL-6的表达高于正常对照组及Sham组， 差异具有统计学意义（P<0.01）， 且于术后12 h达高峰， 随后IL-6的表达下降。Sham组大鼠不同时间点的脊髓组织中IL-6的表达有所增高， 但与正常对照组比较， 差异均无统计学意义（P>0.05）。结论 IL-6在 SCI急性期明显升高， IL-6参与急性 SCI的继发性损害。

【关键词】 脊髓损伤;急性期;白细胞介素-6;动态变化

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2019.32.107

SCI是临床常见的高致残率中枢神经系统损伤性疾病， 是脊柱损伤最严重的并发症。它可导致损伤部位的出血、水肿， 神经细胞凋亡和坏死， 损伤平面以下的运动功能丧失， 以及感觉反射的减弱或消失 [1]。SCI患者给个人、家庭和社会带来巨大的痛苦与负担[2]。一般外力作用下的SCI不能造成脊髓解剖上的完全横断， 而脊髓功能丧失主要是由于急性损伤后脊髓缺血缺氧引起的继发性损害[3]。SCI后多种炎性因子的表达增加， 炎性因子的表达可导致相应的炎性细胞进入受损的脊髓产生炎性反应， 导致受损区域内部环境紊乱， 并且不可能重建SCI中受损的轴突， 从而加重SCI。减少继发性损伤是避免SCI进一步恶化的关键。本实验通过测定SCI中不同时间点IL-6的表达， 寻找治疗的关键时间点， 为SCI的治疗提供理论依据。现报告如下。

1 材料与方法

1. 1 实验动物 SPF级Wistar雄性大鼠120只（由辽宁长生生物技术有限公司提供）， 体重（200±20）g， 分笼饲养， 自然光照， 自由饮食、饮水， 适应性饲养1周。

1. 2 试剂仪器 大鼠IL-6酶联免疫检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）;DY89-Ⅱ电动玻璃匀浆机（宁波新芝生物科技股份有限公司）;DR-200Bs酶标分析仪（无锡华卫德朗仪器有限公司）。

1. 3 实验方法

1. 3. 1 实验分组 将120只Wistar大鼠随机分为正常对照组（8只）、Sham组（56只）、SCI组（56只）。Sham组和SCI组分别于术后0、2、4、8、12、24、48 h取材， 每个时间点取8只大鼠。

1. 3. 2 大鼠SCI模型制备及术后处理 术前将大鼠禁食水12 h， 腹腔麻醉（1%戊巴比妥钠， 40 ml/kg体重）。麻醉起效后， 将大鼠俯卧位固定在手术台上， 术区备皮， 常规消毒铺巾。以T10为中心做背部正中切口， 分离皮下组织及骨骼肌， 暴露T9～11， 剔除该节段棘突及椎板（操作中保持硬脊膜完整）， 显露相应脊髓节段作为造模区。采用改良的Allens撞击法[4]， 使8 g（直径2 mm）金属圆柱体从高度50 mm处通过导管（内径2.5 mm）自由落下， 对大鼠脊髓进行定量打击（撞击力为下落高度50 mm×圆柱体重量8 g）， 建立大鼠急性SCI模型。造模成功的标志：大鼠表现出尾部短暂摇摆， 双后肢和身体回缩式扑动， 继而双后肢呈迟缓性瘫痪。逐层缝合。术后常规护理， 人工辅助白天每4 h排尿、排便1次， 直至相应时间点处死。正常对照组未进行手术操作;Sham组只咬除棘突并且不损伤脊髓。

1. 3. 3 实验动物取材 Sham组和SCI组分别于术后0、2、4 、8、12、24、48 h处死各组大鼠， 正常对照组于术后48 h处死。沿原手术切口， 取出损伤段和上下各5 mm的脊髓组织， 称重。按1︰9比例加入生理盐水， 用电动玻璃匀浆机研磨脊髓组织， 并于离心机上以3000 r/min离心10 min， 取上清液， -20℃保存。

1. 3. 4 观察指标及判定标准 比较三组大鼠不同时间点的BBB评分及脊髓组织中IL-6的表达。采用BBB对各组大鼠的运动功能进行评分， 分值为0～22分， 0分为完全瘫痪， 22分为完全正常， 评分越高表示大鼠后肢运动功能越好[5]。采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测脊髓组织中IL-6的表达。

1. 4 统计学方法 采用SPSS17.0统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

大鼠在麻醉后进行SCI手术操作， 术后约1～2 h清醒。清醒后大鼠行动迟缓、二便障碍、双下肢瘫痪， 进食、进水情况较差。

实验过程中死亡3只大鼠：SCI组和Sham组大鼠过度麻醉各死亡1只， SCI组大鼠术后因泌尿系感染死亡1只。Sham组大鼠因手术操作失误至下肢轻度功能障碍剔除2只。其余大鼠均存活至取材时间点， 各组死亡及剔除大鼠于实验中随时补齐。

2. 1 三组大鼠不同时间点的BBB评分比较 正常对照组大鼠不同时间点的BBB评分均为满分21分。Sham组大鼠不同时间点的BBB评分均为满分21分。SCI组大鼠术前BBB评分为满分;术后， SCI组4、8、12、24、48h的BBB评分分别为（0.1±0.316）、（0.2±0.422）、（0.6±0.699）、（1.2±0.632）、（1.9±0.876）分， 均低于正常对照组及Sham组， 差异具有统计学意义（P<0.01）;且术后48 hBBB评分高于术后4 h， 差异具有统计学意义（P<0.05）。见图1。

2. 2 三组大鼠不同时间点脊髓组织中IL-6的表达比较 正常对照组大鼠不同时间点的脊髓组织中IL-6的表达较少， Sham组大鼠不同时间点的脊髓组织中IL-6的表达有所增高， 但与正常对照组比较， 差异均无统计学意义（P>0.05）。SCI组大鼠术后各时间点大鼠脊髓组织中IL-6的表达高于正常对照组及Sham组， 差异具有统计学意义（P<0.01）， 且于术后12 h达高峰， 随后IL-6的表达下降。见表1， 图2。

3 讨论

在脊髓发生原发性损伤后， 随之而来的继发性损伤是導致神经通路损伤和功能障碍的主要原因[6]。炎性细胞因子及炎性反应在继发性损伤的各种机制中起着重要作用， IL-6又是其中主要成员[7]。作为细胞间信号传导的介质， 它广泛参与调节细胞功能， 维持动物体的内环境稳定。正常情况下， 神经系统内IL-6水平表达比较低， 但一定浓度的IL-6是维持神经细胞正常生长和生存的基础， 而且还会影响神经细胞的分化、生长和生存。

本验结果显示， SCI组大鼠术后BBB评分均低于正常对照组及Sham组， 差异具有统计学意义（P<0.01）;且术后48 h BBB评分高于术后4 h， 差异具有统计学意义（P<0.05）。SCI组大鼠术后各时间点大鼠脊髓组织中IL-6的表达高于正常对照组及Sham组， 差异具有统计学意义（P<0.01）， 且于术后12 h达高峰， 随后IL-6的表达下降。Sham组大鼠不同时间点的脊髓组织中IL-6的表达有所增高， 但与正常对照组比较， 差异均无统计学意义（P>0.05）。

IL-6是炎性细胞分化的重要调节因子[8]。IL-6对中枢神经系统的影响是双向的， 不仅可以促进激活的巨噬细胞分化和浸润， 还可以上调其他细胞因子的表达， 从而加强炎性反应。IL-6过度表达引起脊髓继发性损伤的同时也促进神经干细胞向神经胶质细胞分化[9， 10]。研究促炎因子达到峰值的时间点、阻断SCI期间的继发性损伤是SCI早期治疗的最主要目标。

综上所述， IL-6在 SCI急性期明显升高， IL-6参与急性 SCI的继发性损害。

参考文献

[1] 全仁夫， 李长明， 谢尚举， 等. 芒针治疗对脊髓损伤大鼠TNF-α、IL-6β、IL-1β、NF-Kβ表达的影响. 中医临床研究， 2015， 7（28）：5-8.

[2] 杨彦玲， 师养荣. 脊髓损伤治疗的研究进展. 中国临床神经外科杂志， 2011， 16（10）：633-635.

[3] 蒋恺骉， 于博， 劳立峰， 等. 急性脊髓损伤脊髓与脑脊液中炎性因子相关性的实验研究. 中国矫形外科杂志， 2016， 24（14）：1308-1313.

[4] 程素利， 徐家淳， 王剑歌， 等. 急性脊髓损伤大鼠Allens造模方法的改良及行为学评价. 四川中医， 2015（10）：43-45.

[5] Basso DM， Beattie MS， Bresnahan JC. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. Journal of Neurotrauma， 1995， 12（1）：1.

[6] Boldin C， Raith J， Fankhauser F， et al. Predicting neurologic recovery in cervical spinal cord injury with postoperative MR imaging. Spine， 2006， 31（5）：554-559.

[7] Lee YL， Shih K， Bao P， et al. Cytokine/Chemokine expression in contused rat spinal cord. Neurochemistry International， 2000， 36（4-5）：417-425.

[8] Mukaino M， Nakamura M， Okada S， et al. [Role of IL-6 in regulation of inflammation and stem cell differentiation in CNS trauma]. Nihon Rinshō Men'eki Gakkai kaishi = Japanese journal of clinical immunology， 2008， 31（2）：93-98.

[9] Kang MK， Kang SK. Interleukin-6 induces proliferation in adult spinal cord-derived neural progenitors via the JAK2/STAT3 pathway with EGF-induced MAPK phosphorylation. Cell Proliferation， 2010， 41（3）：377-392.

[10] 钱列， 劳立峰， 蒋恺骉， 等. 急性脊髓损伤脑脊液中炎性因子IL-6、IL-8的表达. 脊柱外科杂志， 2016， 14（5）：272-276.

[收稿日期：2019-03-19]