单核巨噬细胞亚群在结缔组织病相关间质性肺病中的表达研究

王丽平，陈雪芬，赵茂，李学任，刘斌△，彭守春△

单核细胞因具有吞噬和产生细胞因子、促进胶原合成以及血管生成等作用，从而在炎症及免疫反应中扮演重要角色。2010年国际单核细胞/树突细胞命名委员会根据细胞表面CD14和CD16的表达情况，将人类循环中的单核细胞分为经典型（CD14++CD16-，Mon1）、中间型（CD14++CD16+，Mon2）和非经典型（CD14+CD16++，Mon3）3 个亚群［1］。在疾病状态下，单核细胞亚群的分化及功能状态发生改变从而参与疾病的发展过程，例如循环中的CD16+单核细胞增加［2-3］，并与不良临床预后有关［4-5］。

与单核细胞相似，巨噬细胞具有较强的异质性，随周围环境的变化发生亚群的偏移和功能状态的改变［6］。目前巨噬细胞可分为M1型和M2型，其中M2型巨噬细胞在纤维化期促进细胞外基质沉积、瘢痕形成中发挥重要作用，与多种纤维化疾病的发生发展密切相关。此外，在炎症条件下，Ly-6Clow单核细胞可能是肺巨噬细胞的前体细胞［7］。本课题组前期研究证实，在博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化模型中，单核巨噬细胞亚群均呈现动态变化［8］，与间质性肺病（interstitial lung disease，ILD）的发生发展存在密切联系。而目前单核巨噬细胞亚群在结缔组织病相关肺间质病变（connective tissue associated interstitial lung disease，CTD-ILD）中的表达情况尚不清楚。本研究通过对CTD-ILD患者、单纯CTD（CTD-nILD）患者、健康体检者循环单核细胞亚群及支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中巨噬细胞亚群的测定，进一步探讨不同单核巨噬细胞亚群在CTD-ILD 中的表达水平，为下一步探讨单核巨噬细胞不同亚群在CTD-ILD发病中的作用打下基础。

1 对象与方法

1.1 研究对象 收集于2017年7月—2018年2月在中国人民武装警察部队特色医学中心呼吸与重症医学科住院的CTD 患者 77 例，其中男 21 例，女 56 例，年龄 30～83 岁，平均（60.17±12.78）岁。将患者分为单纯CTD组（CTD-nILD组）30例和CTD 合并ILD 组（CTD-ILD 组）47 例。同时选取年龄及性别相仿的健康体检者30例作为健康对照组（NC组）。3组一般资料差异无统计学意义，见表1。将CTD-ILD 组中行支气管镜检查的患者作为试验组，选取不明原因咳嗽或胸闷、且支气管肺泡灌洗液细胞学常规检查无异常的患者作为对照组。该组患者行支气管镜检查的目的在于排除支气管疾病以明确诊断。收集2 组患者的BALF 检测巨噬细胞亚群，其中试验组25例，男10例，女15例，平均年龄（59.44±10.74）岁。对照组20 例，男8 例，女12 例，平均年龄（44.90±9.04）岁。本研究通过本院伦理委员会审查同意，所有患者均签署知情同意书。

Tab.1 Comparison of the general data between three groups表1 各组研究对象一般资料比较

1.2 诊断、纳入与排除标准 诊断标准：所选病例应符合2010年美国风湿病学会（ACR）和欧洲抗风湿病联盟（EULAR）提出的类风湿关节炎（RA）诊断标准、2012年系统性红斑狼疮国际临床协作组（SLICC）修订的系统性红斑狼疮（SLE）分类标准、1975年Bohan 提出的多发性肌炎/皮肌炎（PM/DM）诊断标准、2002年干燥综合征（SS）国际诊断标准、2013年ACR/EULAR 系统性硬化症（SSc）分类标准、1999年Danieli 提出的未分化结缔组织病（UCTD）的诊断标准以及1987年Sharp提出的混合型结缔组织病（MCTD）的诊断标准。本研究中，CTD-ILD 组中 RA 患者 17 例，SLE 患者 1 例，PM/DM 患者 9 例，SS 患者 8 例，SSc 患者 5 例，UCTD 患者 3 例，MCTD 患者 4 例；CTD-nILD 组中 RA 患者 14 例，SLE 患者 4例，PM/DM患者1例，SS患者4例，SSc患者2例，UCTD患者3例，MCTD患者2例。

纳入标准：年龄18～70 岁，入选患者均无糖皮质激素及免疫抑制剂使用史，或已停用糖皮质激素及免疫抑制剂半年以上。排除标准：（1）除外环境因素、职业因素、药物因素及感染因素等其他原因导致的ILD。（2）合并有恶性肿瘤、感染、肺静脉闭塞，慢性阻塞性肺疾病等。（3）妊娠及哺乳期妇女。（4）职业、药物、遗传、环境因素引起的肺部病变，家族性特发性肺纤维化。（5）严重脏器功能不全如肺动脉高压，先天性心脏病，左心功能衰竭等。（6）近期发生肺部感染者。

1.3 方法

1.3.1 一般临床资料的收集 收集入组患者的性别、年龄、胸部高分辨率CT（High resolution CT，HRCT）检查、肺功能检查［包括用力肺活量（FVC）、一氧化碳弥散量（TLCO）］等临床资料。

1.3.2 主要试剂与仪器 流式细胞术检测单核细胞亚群所用抗CD14-FITC、抗CD16-PE、抗CD86-PE-Cy5及抗CD41-PE-Cy7 抗体均购自美国Biolegend 公司，流式细胞术检测巨噬细胞亚群所用抗CD11b-FITC、抗CD169-PE、抗CD206-PE-Cy5、抗CD163-PE-Cy7 抗体均购自美国Biolegend 公司。流式细胞仪Cytomics FC 500 购自美国Beckman-Coulter 公司，肺功能仪购自德国Master Screen Diffusion公司，电子支气管镜购自日本OLYMPUS公司。

1.3.3 外周血单核细胞亚群检测方法 所有患者入院后24 h 内采取晨起空腹外周静脉血2 mL，血液样本在采血后2 h内须完成单核细胞亚群流式细胞术分析。取新鲜EDTA抗凝全血标本 50 μL 加入 10 μL 抗人CD14、10 μL 抗人CD16、10 μL抗人CD86、10 μL抗人CD41进行抗体标记。室温避光条件下孵育15 min 后加1 mL 红细胞裂解液，涡旋混匀后孵育10 min，上机检测。根据CD14和CD16的荧光强度不同划分为Mon1、Mon2 和Mon3 亚群。流式结果的分析采用FlowJo 7.6软件。

1.3.4 BALF 巨噬细胞亚群检测方法 新鲜BALF 100 μL加入20 μL CD11b、CD169、CD206 荧光抗体混匀孵育20 min，300×g离心5 min 弃上清；加1∶9配制的溶血素2 mL，避光10 min，200×g离心5 min弃上清液；加入PBS缓冲液，300×g离心5 min 弃上清，加0.5 mL PBS 重悬细胞，上机待测。根据CD163+/CD163++的表达情况分析巨噬细胞亚型比例。流式结果分析采用FlowJo 7.6软件。

1.3.5 ILD 患者的HRCT 表现 由1 位放射科医师和2 位呼吸科医师分别对胸部HRCT的病变范围进行评估，取主动脉弓上缘、隆突、膈肌上1 cm 水平，分别计算3 个层面纤维化（蜂窝影和网格影）和磨玻璃影占相应肺野面积的百分比。当受累面积为0 时为0 分，1%～25%时计1 分，26%～50%计2分，51%～75%计3 分，76%～100%计4 分，将评分相加即为相应评分。

1.3.6 肺功能检查 用鼻夹将患者鼻子夹住，尽可能含紧一次性口含嘴，患者平静呼吸4～5 个循环，待潮气末基线平稳后，让患者快速呼气至残气量位；然后快速均匀吸气至肺总量位；接着屏气10 s，最后在2～4 s内用力将全部气体均匀呼出至残气量位；再做1次平静呼吸，记录FVC和TLCO。

1.4 统计学方法 采用SPSS 22.0 统计软件进行数据处理。计数资料以例（%）表示，组间比较采用χ2检验。符合正态分布的连续型变量资料以均数±标准差（±s）表示，2 组间比较采用独立样本t检验；多组组间比较采用单因素方差分析，经方差齐性检验，方差齐时采用LSD-t法进行组间多重比较；方差不齐时用Dunnett's T3法进行组间多重比较。正态分布的连续型变量资料之间采用Pearson 检验行相关性分析，非正态分布的连续型变量资料之间采用Spearman 检验行相关性分析。以双侧α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 循环单核细胞亚群比例检测结果 CTD-nILD组和 CTD-ILD 组 Mon1 亚群比例低于 NC 组（P＜0.05），CTD-nILD 组与 CTD-ILD 组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；CTD-nILD组和CTD-ILD组Mon2亚群比例均明显高于NC 组，CTD-ILD 组高于CTD-nILD 组（P＜0.05）；Mon3 亚群比例在 NC 组、CTD-nILD 组和CTD-ILD 组间差异均无统计学意义。见表2。

Tab.2 Monocyte subsets detected by flow cytometry in three groups表2 流式细胞术检测各组循环单核细胞亚群比例分布情况

2.2 CTD-ILD 组单核细胞亚群水平与HRCT 评分的相关性分析 47 例CTD-ILD 患者均完成HRCT检查，Pearson 相关分析显示，Mon2 亚群比例与HRCT磨玻璃影评分呈正相关（P＜0.05）。见表3。

Tab.3 Correlation of the percentage of monocyte subsets with HRCT scores in the CTD-ILD group表3 CTD-ILD组单核细胞亚群比例与HRCT评分的相关性分析

2.3 CTD-ILD 组循环单核细胞亚群水平与肺功能指标的相关性分析 CTD-ILD 组共有36 例患者行肺功能检查，其中29例完成弥散功能检查。Pearson相关分析显示，单核细胞3 个亚群比例与肺功能指标均无线性相关关系（均P＞0.05）。见表4。

2.4 BALF 巨噬细胞亚群比例检测结果 试验组M1 比例明显低于对照组，M2 比例高于对照组（P＜0.05），见表5。25例试验组患者均完成HRCT检查，Pearson 相关分析显示，巨噬细胞亚群比例与HRCT评分均无明显相关关系（均P＞0.05），见表6。试验组患者均行肺功能检查，Pearson 相关分析显示，M2巨噬细胞与肺功能指标均无线性相关关系（均P＞0.05），见表7。

Tab.4 Correlation of the percentage of monocyte subsets with pulmonary function test index in the CTD-ILD group表4 CTD-ILD组单核细胞亚群比例与肺功能指标的相关性分析

Tab.5 Macrophage subsets detected by flow cytometry in the two groups表5 试验组和对照组BALF巨噬细胞亚群比例分布情况

Tab.6 Correlation of the percentage of monocyte subsets with HRCT scores in the CTD-ILD group表6 试验组巨噬细胞亚群比例与HRCT评分的相关性分析

Tab.7 Correlation of the percentage of macrophage subsets with pulmonary function test index in the experimental group表7 试验组巨噬细胞亚群比例与肺功能指标的相关性分析

2.5 Mon2 单核细胞亚群与M2 巨噬细胞亚群的相关性分析 将CTD-ILD 组巨噬细胞亚群比例与相对应的外周血单核细胞亚群比例进行相关分析显示，单核细胞亚群分化和巨噬细胞亚群分化之间无明显线性相关关系（均P＞0.05），见表8。

Tab.8 Correlation of the percentage of monocyte subsets with the percentage of macrophage subsets in the CTD-ILD group表8 CTD-ILD组单核细胞亚群比例与巨噬细胞亚群比例的相关性分析

3 讨论

在正常人体内，CD14++CD16-单核细胞群约占单核细胞的90%，CD16+单核细胞群约占10%，其进一步分为CD14++CD16+亚群和CD14+CD16++亚群［1］。研究表明，Mon2单核细胞比例升高可能与一些炎症性疾病或纤维化疾病的发病机制相关，如RA［9］和肝纤维化［10］。另有研究指出Mon1和Mon2单核细胞比例的升高与特发性肺纤维化（IPF）进展相关，尤其是Mon2 单核细胞比例的升高提示IPF 患者预后更差［11］。可见，单核细胞向Mon2亚群偏移可产生更强的促炎作用，与ILD 的发生有密切关系。同时多项研究表明，巨噬细胞向M2型转化可能参与纤维化疾病的发生发展［12］，在博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化模型中，M2型巨噬细胞在第14天左右达峰值，并且与肺纤维化的程度呈现明显正相关［13］。本研究结果显示，CTD-ILD患者的外周血Mon2单核细胞亚群比例以及BALF 中M2巨噬细胞亚群比例均明显升高，提示二者在CTD-ILD 的不同病理阶段可能发挥一定的促进作用。

近年来有研究发现，Mon2单核细胞可分泌促炎细胞因子，如肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-1β等，从而在疾病状态中发挥更强的促炎作用［14］。同时Mon2 亚群已经被证明可以通过表达血管内皮生长因子促进肌成纤维细胞分化，增加胶原沉积［7］。因此，Mon2 单核细胞比例的升高与一些炎症性疾病/纤维化疾病有关。本研究结果显示，与NC 组相比，CTD-nILD 组与 CTD-ILD 组患者 Mon2 单核细胞比例均升高，其中CTD-ILD 患者Mon2 比例升高更显著。进一步分析发现在CTD-ILD患者中，Mon2水平与HRCT的磨玻璃影评分呈正相关，提示Mon2可能在ILD早期炎症反应阶段发挥更重要的作用。但是未发现单核细胞与肺功能指标之间的关系，可能与样本量较小或者单核细胞检测与肺功能检测不是同时期完成有关。

本课题组前期结果显示，博莱霉素诱导的肺损伤小鼠从炎症期到损伤修复期，BALF 中M1 巨噬细胞逐渐减少，M2型巨噬细胞逐渐增多［13］。在IPF患者和SSc-ILD 患者中，M2 型巨噬细胞表面标志物CCL-18 明显增高，同时与肺纤维化程度呈正相关［15］。本研究结果显示，试验组M2比例明显高于对照组，说明在CTD-ILD 患者中巨噬细胞有向M2 亚群偏移的倾向，与以往研究结果一致。但是本研究并未发现M2 巨噬细胞比例与纤维化评分之间的相关关系，应当注意到二者呈正相关且相关系数较大。下一步应该进一步扩大样本量，并且优化检测方法进一步验证。

Lescoat 等［16］研究显示，CD16+单核细胞不仅与SSc患者肺纤维化严重程度和DLCO的减少有关，而且还被认为是M2巨噬细胞的前体。由此猜测，CTD患者外周血CD16+单核细胞的增加很有可能导致M2型巨噬细胞增多，从而在ILD的发病中发挥重要作用［17］。但是本研究中未发现CD16+单核细胞与M2巨噬细胞之间存在相关性，下一步应扩大样本量进一步观察单核巨噬细胞在肺纤维化发生发展过程中的相互关系。

综上所述，Mon2 单核细胞和M2 巨噬细胞在CTD-ILD 中均显著增高，提示Mon2 单核细胞和M2型巨噬细胞在ILD 的发生发展中可能起重要作用。尤其是Mon2与HRCT磨玻璃影评分呈正相关，提示Mon2单核细胞可能在评价病情方面发挥一定作用，为进一步研究单核巨噬细胞亚群在CTD-ILD 发病机制中的作用提供参考。