荧光原理及影响荧光性质测试的因素

王 稳1 朱倩倩2

(1.河南警察学院 刑事科学技术系，郑州 450046；2. 郑州大学 化学学院，郑州 450001)

1 荧光原理

某些物质被激发后会发射出各种颜色和不同强度的光线，当辐射停止时，所发射的光线即很快消失，这种现象称为荧光。当分子通过吸收辐射能而被激发时，所产生的荧光称为光致发光。本文讨论的荧光测量是光致发光现象。

荧光的形成总是从分子的第一电子激发单重态的最低振动能级开始的，与荧光体被激发到哪一个电子态无关，所以分子荧光光谱的形状(或谱线轮廓)通常与激发光波长无关；在激发光与发射光之间存在着一定的能量损失，所以在溶液荧光光谱中所观察到的荧光的波长总是大于激发光的波长，这种波长移动的现象称为斯托克斯(Stokes)位移；在室温下，分子绝大多数处于电子基态的最低振动能级，因此，吸收光谱(又称激发光谱)中的第一吸收带的形状取决于第一电子激发态中振动能级的分布情况。而分子荧光光谱的形成是激发态分子从第一电子激发态的最低振动能级辐射跃迁至基态的各个不同振动能级所产生的，其形状由基态振动能级的分布情况决定。一般情况下，基态和第一电子激发态中振动能级的分布情况是相似的。由此，分子的荧光光谱和吸收光谱(激发光谱)形状是相似的并呈镜象对称关系[1]。

Φ数值在 0～1 之间。它的大小取决于物质分子的化学结构及环境(温度、pH 、溶剂等)[2]。

相比于相对荧光量子产率测量，绝对荧光量子产率测量应用更为广泛。因为后者无需标准样品，可适用于液体、薄膜和粉末样品。采用爱丁堡FLS980稳态瞬态荧光光谱仪，结合光致发光量子产率附件，可以实现对液体和固体样品绝对量子产率的测量。

当某种物质被一束激光激发后，该物质的分子吸收能量后从基态跃迁至某一激发态上，再以辐射跃迁的形式发出荧光回到基态，当激发停止后，分子的荧光强度降到激发时最大强度的1/e所需要的时间称为荧光寿命，它表示粒子在激发态存在的平均时间，通常称为激发态的荧光寿命。

荧光物质的荧光寿命不仅与自身的结构有关，而且与其所处微环境的极性、粘度等条件有关，因此通过荧光寿命测定可以直接了解所研究体系发生的变化。

2 影响荧光性质测试的因素

以荧光黄乙醇溶液样品为例，研究其稳态荧光光谱测量、荧光量子产率及荧光寿命的测量过程。使用的荧光光谱仪型号为爱丁堡FLS980稳态瞬态荧光光谱仪，扫描步长为1nm。

2.1 激发光谱和荧光发射光谱

首先，样品荧光发射光谱测试前，可通过同步光谱测试来寻找样品的激发波长，但同步光谱扫描寻找样品的激发波长，耗时较长。通过紫外可见吸收光谱测试来初步确定激发波长，扫描得到荧光发射光谱后，固定最佳发射波长，反扫激发光谱，确定样品的激发情况。进而固定最佳激发波长，扫描荧光发射光谱。稳态光谱测试过程中，注意调节合适的狭缝，不能增加信号强度而加大狭缝，因为增加狭缝将导致进入检测器的杂散光强度增加。如需消除二级衍射峰，可通过在发射侧加入滤光片来实现，一般滤光片波长应与激发波长接近，相差20～30nm[3,4]。爱丁堡FLS980荧光光谱仪设有内置滤光片轮，可用来消除二级衍射峰。

图1 荧光黄乙醇溶液的激发光谱

荧光黄乙醇溶液的激发光谱如图1所示，其最佳激发波长为490nm。若采用490nm作为最佳激发波长进行发射光谱测试，起始扫描波长一般比490nm大20 ～ 30 nm，荧光峰值出现在513nm处，但荧光峰并不完整。因此，可调整激发波长，保证荧光图谱完整。本文中，采用380 nm作为激发波长，测得其荧光发射光谱如图2所示。

图2 荧光黄乙醇溶液的发射光谱激发波长：380nm

2.2 荧光寿命测试

由于荧光物质的荧光寿命长短与所处的微环境有关，因此将荧光物质溶解在溶剂中进行荧光寿命测试时需要指出选用的溶剂、温度及溶液浓度等。经验得出，在同一种溶剂中进行荧光物质寿命测试时，荧光物质浓度不宜过高，否则可能会因自吸收导致荧光猝灭影响测试结果。测试过程中，光源的脉冲周期应远大于样品的荧光寿命，确保样品荧光强度衰减结束前不会被多次激发。荧光黄乙醇溶液荧光寿命测试时，采用330nm激光器进行激发，脉冲周期为200ns，时间窗口范围为100ns。如图3所示，在100ns的时间范围内，该样品的荧光已经完全衰减结束。对数据进行拟合处理得到其荧光寿命为4.07ns。

图3 荧光黄乙醇溶液的荧光强度随时间的衰减曲线

2.3 荧光量子产率测试

爱丁堡FLS980光谱仪配置积分球附件后，可进行固体、液体荧光样品的绝对量子产率测量，测试过程方便快捷。绝对量子产率测试过程中，需要在相同的仪器参数条件下测试空白样品和实际荧光样品。对于溶液样品，空白样品为将荧光物质去除之后的组分，测试时空白溶液的体积、所使用的比色皿与测试溶液相同。对于固体粉末样品，测试前需要进行研磨，尽量保证样品装样后样品高度和表面与空白样品保持一致，爱丁堡积分球附件配有白板，无需额外选用空白样品。

量子产率测试时，注意空白样品和实际样品测试时确保仪器参数条件一致。所选用的激发波长需与实际样品的荧光发射区域有合适的间隔，避免数据处理时，荧光发射区域与激发光散射峰有重叠，影响最终测试结果的准确性。

3 结语

结合实际测试经验，介绍了荧光原理、荧光相关性质-荧光寿命、荧光量子产率测量原理及实际测量中包括稳态光谱测试、瞬态荧光寿命测试和绝对量子产率测试的影响因素，通过了解这些影响因素，提高样品测试的准确性。