一株侧孢芽孢杆菌发酵条件和培养基的优化

廖先清 刘芳 周荣华 饶犇 陈伟 王开梅

摘要：为获得一株侧孢芽孢杆菌（Bacillus laterosporus）（NBF-129）发酵工艺，以发酵液活芽孢数为指标，在单因素试验基础上，采用正交试验对其培养基及培养条件进行优化。培养基优化结果为玉米淀粉2.0%、蚕蛹粉2.5%、酵母浸出粉1.0%、玉米浆1.0%。最佳培养条件为初始 pH 7.5，培养温度30 ℃，转速220 r/min。优化后的侧孢芽孢杆菌摇瓶发酵液芽孢数达到4.12×109 CFU/mL，较优化前的2.30×109 CFU/mL提高79.1%。利用优化后的培养基和培养条件进行了30 L罐发酵小试，发酵周期为35 h，发酵液芽孢数为3.96×109 CFU/mL，发酵液离心浓缩后菌浆冷冻干燥，得到原粉芽孢数为6.70×1010 CFU/g。

关键词：侧孢芽孢杆菌（Bacillus laterosporus）;发酵;培养基优化;正交试验

中图分类号：Q93;TQ920.6         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2019）20-0097-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.20.022           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Optimization of culture medium and growth condition of Bacillus laterosporus

LIAO Xian-qing，LIU Fang，ZHOU Rong-hua，RAO Ben，CHEN Wei，WANG Kai-mei

（Hubei Biopesticide Engineering Research Center/Biopesticide Subcenter of Hubei Science

and Technology Innovation Center，Wuhan 430064，China）

Abstract： In order to obtain the fermentation process of a strain of Bacillus laterosporus NBF-129， the culture medium and conditions were optimized by single factor experiment and orthogonal test， using the number of viable spores in the fermentation broth as an index. The optimal fermentation medium were（%）： corn starch 2.0， silkworm pupa meal 2.5， yeast extract 1.0， corn steep liqour 1.0. The optimal fermentation conditions were： initial pH 7.5， culturing temperature 30 ℃， rotation speed 220 r/min. After optimization， the number of viable spores in the fermentation broth reached 4.12×109 CFU/mL， which was 79.1% higher than 2.30×109 CFU/mL before optimization. Under the optimized medium and optimal culturing conditions， a 30-liter tank fermentation test was conducted. The incubation time was 35 hours， The number of viable spores in the fermentation broth reached 3.96×109 CFU/mL. After being concentrated and freeze-dried， the number of raw powder spores was 6.70×1010 CFU/g.

Key words： Bacillus laterosporus; fermentation; culture medium optimization; orthogonal test

側孢芽孢杆菌（Bacillus laterosporus）是一种好氧型芽孢杆菌，其显著特点是有独木舟状侧孢，侧孢与芽孢紧密相连，当孢囊溶解后侧孢依然牢固地与芽孢结合在一起[1]。侧孢芽孢杆菌具有杀虫、抗菌、解磷、解钾、促生等多种生物学活性，在功能微生物菌剂开发等方面具有良好的应用前景[2]。因其具有抗逆性强、繁殖所需时间短、营养要求简单、易于工业化生产、易定殖等特点，其活菌制剂广泛用于土传病虫害防治、土壤污染修复、保水抗旱、连作障碍防治、水产养殖等功能性微生物菌剂的研究与开发。

侧孢芽孢杆菌在实际生产中存在发酵产量偏低、工业化生产不稳定等问题，因此本研究以发酵液中的活芽孢数为指标，采用单因素试验结合正交试验对侧孢芽孢杆菌发酵培养基、培养条件进行优化，以提高其发酵水平，为该菌株的工业化生产奠定基础[3]。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  菌株  侧孢芽孢杆菌NBF-129由湖北省生物农药工程中心发酵工程研究室从蔬菜根际土壤样品中分离得到并保存。

1.1.2  培养基  ①LB培养基。胰蛋白胨10 g，氯化钠5 g，酵母提取物5 g，去离子水1 L，pH 7.0。②基础发酵培养基。玉米淀粉20 g，酵母浸粉7.5 g，蛋白胨15 g，碳酸钙1.5 g，磷酸二氢钾1.0 g，硫酸镁0.3 g，去离子水1 L，pH 7.0～7.5。

1.2  方法

1.2.1  培养方法  ①斜面活化培养。将保存于沙土管的菌种转接于斜面培养基，30 ℃培养至全部形成孢子。②种子液的制备。将斜面菌种活化，接种到液体LB培养基中，在温度为30 ℃、转速200 r/min的条件下培养12～16 h，作为种子液备用。③摇瓶发酵培养。取1 mL种子液接种至发酵培养基，摇瓶发酵装液量为50 mL/500 mL，30 ℃、200 r/min振荡培养至芽孢20%左右脱落。

1.2.2  发酵条件的优化  分别考察不同培养基初始pH、培养温度以及转速对侧孢芽孢杆菌NBF-129菌株发酵生长的影响。按基础发酵培养基配制并接种，振荡培养至芽孢20%脱落，测定发酵液的活芽孢数[4]。

1.2.3  培养基的优化  ①碳源单因素筛选。固定基础发酵培养基中的碳源和无机盐选取葡萄糖、糖蜜、红薯粉、玉米淀粉等几种常见的工农业产品或副产物作为碳源进行筛选，考察不同的碳源对侧孢芽孢杆菌菌株生长的影响。糖蜜用量按干物质含量折算。分别按照配方配制培养基并接种，振荡培养至芽孢20%脱落，测定发酵液的活芽孢数。通过单因素试验确定适宜的碳源。②氮源单因素筛选。固定基础发酵培养基中的碳源和无机盐，选取蚕蛹粉、菜粕、酵母浸粉、玉米浆、豆粕、鱼蛋白胨等6种常见的工农业副产物作为氮源进行筛选，考察不同的氮源对侧孢芽孢杆菌菌株生长的影响。玉米浆用量按干物质含量折算。分别按照配方配制培养基并接种，振荡培养至芽孢20%脱落，测定发酵液的活芽孢数。通过单因素试验确定适宜的氮源。③培养基优化的正交试验。根据单因素试验结果，选取玉米淀粉作为碳源，综合搭配速效氮源和迟效氮源，选择蚕蛹粉、酵母浸粉和玉米浆（既能作为氮源又能提供生长因子）作为复合氮源，无机盐固定为碳酸钙0.1%，硫酸镁0.03%，磷酸二氢钾0.1%，进行4因素3水平L9（34）的正交试验（表1），振荡培养至芽孢20%脱落时下摇床，以发酵液芽孢数作为评价指标，确定最佳培养基组合。

1.2.4  30 L罐发酵小试  利用发酵条件优化得到的工艺、单因素和正交试验得出的最佳配方，在30 L发酵罐中进行发酵试验，装液量18 L，消泡剂0.1%，灭菌前pH调至7.5，灭菌、降温至32 ℃，接入100 mL种子液，转速控制0～5 h 200 r/min，5～8 h 350 r/min，8 h后500 r/min，通气量1.2 m3/h，罐压0.5×105 Pa，培养温度（31±0.5） ℃，培养至芽孢脱落20%时放罐。发酵液采用高速离心机离心，5 000 r/min离心10 min，弃去部分上清液，得到3倍浓缩液，浓缩液冷冻干燥得到冻干粉。

1.2.5  测定方法  活芽孢产量测定采用稀释平板计数法测定每单位体积或单位重量内含有的活芽孢数，稀释液置于80 ℃水浴20 min后涂布平板。

1.2.6  数据统计与分析  因素显著性利用Latin软件进行方差分析。

2  结果与分析

2.1  发酵条件的优化

2.1.1  初始pH  从图1可知，当初始pH为6.0时，侧孢芽孢杆菌NBF-129培养35 h，芽孢形成率40%左右，芽孢数较低，菌体有自溶现象;当初始pH为7.5时，侧孢芽孢杆菌NBF-129的发酵芽孢数达到最高，为23.8×108 CFU/mL，芽孢形成率达到95%。初始pH太高或太低均不利于菌体生长和芽孢形成，因此选择pH 7.5作为侧孢芽孢杆菌发酵初始pH。

2.1.2  培养温度  由图2可知，当培养温度为30 ℃时侧孢芽孢杆菌NBF-129的芽孢数达到最高，为24.8×108 CFU/mL;当培养温度为40 ℃时，菌体大部分不能形成芽孢且极不整齐。培养温度过高影响酶活，芽孢形成受阻。因此选择30 ℃作为侧孢芽孢杆菌NBF-129培养温度。

2.1.3  转速  如图3所示，当摇床转速为180和220 r/min时，侧孢芽孢杆菌NBF-129的芽孢数均在23×108 CFU/mL左右，表明侧孢芽孢杆菌NBF-129是严格好氧菌。转速在180 r/min时较220 r/min发酵周期延长1 h，综合经济和动力因素，将侧孢芽孢杆菌NBF-129的培养摇床转速确定为220 r/min。

2.2  培养基的优化

2.2.1  碳源单因素筛选  从图4可以看出，不同碳源对侧孢芽孢杆菌NBF-129发酵的芽孢数有较大影响，葡萄糖作为碳源时效果最差，芽孢数仅为5.8×108 CFU/mL，可能是因为葡萄糖是速效碳源，过多的葡萄糖会引起底物阻遏效应，使侧孢芽孢杆菌自身的酶系活性下降，影响产物合成水平及芽孢形成。玉米淀粉作为碳源的效果最好，发酵液芽孢数为24.5×108 CFU/mL，因此选择玉米淀粉为侧孢芽孢杆菌NBF-129的碳源。

2.2.2  氮源单因素筛选  由圖5可知，侧孢芽孢杆菌NBF-129在含有蚕蛹粉、酵母浸粉、玉米浆、豆粕的培养基中生长良好，活芽孢数均较高，其中在蚕蛹粉作为单一氮源的培养基中芽孢数达35.2×108 CFU/mL。综合搭配速效氮源和迟效氮源，选择蚕蛹粉、酵母浸粉和玉米浆（既能作为氮源又能提供生长因子）复合氮源作为侧孢芽孢杆菌NBF-129培养基的氮源。

2.2.3  正交试验结果  由表2和表3的结果分析可知，影响侧孢芽孢杆菌NBF-129发酵水平主次因素关系为蚕蛹粉>酵母浸粉>玉米浆>玉米淀粉，蚕蛹粉的F为1.537，对发酵的影响最大，其次是酵母浸粉和玉米浆，而玉米淀粉对发酵的影响较小。侧孢芽孢杆菌NBF-129的因素最佳水平为A1B2C3D2，即发酵最佳培养基为（%）：玉米淀粉2.0，蚕蛹粉2.5，酵母浸粉1.0，玉米浆1.0，碳酸钙0.1，硫酸镁0.03，磷酸二氢钾0.01。

2.3  30 L罐发酵小试

利用单因素筛选和正交试验得到的最佳配方进行30 L罐发酵小试，发酵周期35 h，发酵液显微镜检孢子形成率95%左右，孢子20%脱落，大小整齐，发酵液孢子数为39.6×108 CFU/mL，3倍浓缩液得到的冻干粉孢子数为6.70×1010 CFU/g。

3  讨论

从蔬菜根际土壤分离得到侧孢芽孢杆菌，为了获得其生长的最适培养基及条件，通过单因素试验及正交试验对其生长培养基及其条件进行优化。利用优化后的培养基和发酵工艺进行30 L罐发酵小试，发酵周期35 h，发酵液孢子数为39.6×108 CFU/mL，3倍浓缩液得到的冻干粉孢子数为6.70×1010 CFU/g。优化后的发酵培养基原材料皆为工农业副产品，来源广泛，发酵工艺简单，为中试和工业化生产奠定基础[5]。优化的培养基主要氮源蚕蛹粉粗蛋白质含量高，且富含蛋氨酸、赖氨酸，与进口鱼粉大体相当，价格仅为鱼粉的一半，是很好的蛋白原料。侧孢芽孢杆菌培养基优化中单一速效碳氮源效果都不佳，可能是因为速效碳氮源有利于菌体生长但对代谢产物合成和芽孢形成有一定的阻遏作用，因此原材料的选择要结合速效和迟效碳氮源搭配使用。

侧孢芽孢杆菌次生代谢产物具有生物学功能多样性，能产生具有较高活性的酶类、激素、细菌素、多肽抗生素等[6]，而这些物质大多是水溶性的。本试验侧孢芽孢杆菌30 L罐发酵小试仅采用离心和冷冻干燥后处理方式，活性物质的收集有一定损失，后期还要优化浓缩和利用干燥工艺，同时提高活芽孢和活性物质的收率。

参考文献：

[1] 邢芳芳，宋  涛，徐文凤，等.侧孢芽孢杆菌在生防中的应用及研究进展[J].山东农业科学，2014，46（6）：146-149.

[2] 张念海，易安妮，丛  莉，等.侧孢芽孢杆菌2002的培养特性及发酵条件优化[J].生物工程，2011，32（3）：152-156.

[3] 趙云彤.侧孢芽孢杆菌HBL-26发酵条件的优化研究[J].黑龙江农业科学，2012（5）：112-116.

[4] 叶碧霞，左  勇，傅  彬，等.一株枯草芽孢杆菌培养基及培养条件的优化[J].生物工程，2017，42（1）：23-28.

[5] 许丽娟，刘冬华，刘  红，等.我国微生物农药的应用现状及发展前景[J].农药研究与应用，2008，12（1）：9-11.

[6] 张  楹.侧孢芽孢杆菌产生的抑真菌蛋白酶[J].中国生物防治，2006，22（2）：146-149.