重庆市荣昌区动物源沙门菌的检测与耐药性分析

牟 豪 余远迪 翟少钦

重庆市畜牧科学院，重庆荣昌402460

沙门菌是一种重要的人兽共患病病原菌，血清型众多且宿主广泛，不仅可以感染人，还能感染畜禽类动物及野生动物[1]，给畜禽养殖业带来了巨大的经济损失。同时，沙门菌可以通过食物链传递给人类，最终导致人类发病的风险[2]。目前，在我国畜禽业养殖过程中，抗菌药物不仅被用来治疗由细菌引起的各种疾病，而且部分抗菌药物还被用作预防动物疾病和动物促生长剂。这可能导致临床分离株加速成为多重耐药株，给临床治疗带来难度[3]。

本研究从位于重庆市荣昌区的畜禽养殖场中分离得到沙门菌临床分离株，并对其血清型和药物敏感性进行分析，以期为荣昌区畜禽源沙门菌的耐药规律提供基础数据以及指导临床合理用药。

1 材料与方法

1.1 材料

1）样品来源。样品为2018年10月至2018年11月采集于重庆市荣昌区的一家规模化生猪养殖场的80 份猪粪便和一家肉鹅养殖场的30 份鹅粪便。所有样品为健康猪和鹅的新鲜粪便。采集的样品均置于有冰袋的泡沫箱中，6 h 之内运回实验室进行处理。共采集样品110 份。

2）主要试剂。缓冲蛋白胨水（BPW）、四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液、XLD 琼脂（海博生物技术有限公司）；革兰氏染色液、药敏纸片（杭州微生物试剂有限公司）；沙门菌诊断血清（宁波天润生物药业有限公司）。所有试剂和培养基均在有效期内并经过验证。

1.2 方法

1）样品的处理。样品经BPW 前增菌和TTB 选择性增菌后，将菌液划线接种于XLD 平板，37℃培养18～24 h。每个平板挑取3～5个透明、中心带有黑点或不带黑点的疑似沙门菌菌落划线于LB 平板，37℃培养20 h。挑取单个菌落，革兰染色，观察细菌形态。

2）临床菌株的PCR检测。引物设计与合成：参考国标GB/T 28642-2012《饲料中沙门菌的快速检测方法-聚合酶链式反应（PCR）法》中扩增沙门菌特异性基因invA。invA-F：5'-TCGCACCGTCAAAGGAACCGTAAAGC-3’和invA-R：5'-GCATTATCGATCAGTACCAGCCGTCT-3'。分离菌株的PCR鉴定：水煮法提取菌液DNA，随后进行PCR扩增。反应体系：2×Taq Mix 12.5 μL，invA-F（10 μmol/L）1 μL，invA-R（10 μmol/L）1 μL，模板DNA 2 μL，dd H2O 8.5 μL，总反应体系25 μL。反应条件：94℃预变性2 min，94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30个循环；最后72℃延伸6 min。经1.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察结果。以沙门菌ATCC 25923 作为阳性对照。

3）沙门菌的血清型鉴定。将分离鉴定的沙门菌分离株在LB 平板上划线培养18～24 h，作为玻片凝集试验用的抗原。首先，在平板上挑取1个单菌落与1 滴生理盐水混合均匀，观察是否有凝集反应，然后对无自凝性的沙门菌进行血清学鉴定。其次，采用沙门菌诊断血清进行沙门菌多价菌体抗原（O）的鉴定，再对多价鞭毛抗原（H）进行鉴定。对照Kauffmann-White 抗原表判定沙门菌血清型。

4）药物敏感性试验。根据美国临床和实验室标准协会（CLST）抗菌药物敏感性试验标准，采用K-B纸片法对沙门菌临床分离株进行药物敏感性试验。以沙门菌ATCC 25923 作为质控菌株。

2 结果

2.1 菌株分离

本研究在110 份样品中，通过选择性培养基的培养和增菌，并通过PCR鉴定共分离到沙门菌8 株（图1），分离率为7.3%（表1）。其中在猪场分离到6 株，在肉鹅场分离到2 株，分离率分别为7.5%和7.3%。

图1 沙门菌特异性基因invA的检测

表1 沙门菌分离鉴定情况

2.2 沙门菌血清型

此次分离的8 株沙门菌中，其中7 株可以通过沙门菌鉴定血清鉴定其血清型，有1 株鹅源沙门菌无法鉴定其血清型。已经鉴定的7 株沙门菌均为血清群B 群，分别为鼠伤寒沙门菌5 株、乙型副伤寒沙门菌1 株和圣保罗沙门菌1 株。5 株鼠伤寒沙门菌中，4 株为猪源沙门菌，1 株为鹅源沙门菌。另外，1 株乙型副伤寒沙门菌和1 株圣保罗沙门菌分别为猪源和鹅源沙门菌（表2）。从血清型分布情况来看，鼠伤寒沙门菌是最常见的血清型（5 株，占总数的62.5%）。

表2 不同动物源沙门菌血清型的分布情况

2.3 药物敏感性

从表3可知，本次从猪和肉鹅中分离到的沙门菌对8 大类抗菌药物中的7 大类抗菌药物产生了不同程度的耐药。其中，分离株对四环素类抗菌药物的耐药现象最为严重，耐药率高达100%。其次，酰胺醇类、青霉素类和氨基糖苷类中的链霉素和庆大霉素的耐药也较为严重，耐药率均大于75%，尤其是链霉素，耐药率更是高达100%。此外，头孢菌素类中，头孢氨苄的耐药情况比较严重，耐药率为62.5%。本次试验的8 株沙门菌分离株未发现对磺胺类药物耐药。

2.4 多重耐药分析

由图2可知，该8 株沙门菌临床分离菌株均为多重耐药菌株，多重耐药率高达100%。从多重耐药菌株的分布情况来看，耐抗菌药物数量从6～17种不等。耐6种、7种和8种抗菌药物的沙门菌分离株均为2 株。分别有1 株鹅源和猪源沙门菌对16种和17种抗菌药物产生耐药。

表3 猪源沙门菌和鹅源沙门菌的耐药情况

图2 不同动物源沙门菌分离株的多重耐药情况

3 讨论

沙门菌是重要的人畜共患肠道病原菌，猪感染致病性沙门菌后会导致猪患副伤寒、肠炎或腹泻等疾病。肉鹅感染致病性沙门菌后临床表现为下痢、结膜炎和消瘦[4]。刘丽娟等[5]在2018年报道了来自于腹泻仔猪的肠道沙门菌的分离率为22.7%。焦连国等[6]从我国多个省份的仔猪腹泻样品中分离到的沙门菌的平均分离率为11.56%，其中，在重庆地区的分离率高达42.9%。这些研究结果都远高于本试验的猪源沙门菌的分离率，这可能是由于猪腹泻样本受沙门菌感染的可能性很高，同时沙门菌的分离率还与不同区域、采集季节、培养方式、分离方式以及环境条件相关。

从耐药情况来看，沙门菌分离株对四环素类抗菌药物的耐药现象最为严重，其次为酰胺醇类、青霉素类和氨基糖苷类。这可能与养殖场在日常的饲养管理和疾病预防中经常使用该类抗生素有关。值得注意的是，本研究分离的沙门菌均为多重耐药株。在今后的畜禽生产中应该合理地使用抗菌药物，避免菌株多重耐药现象的发生给养殖业和人类健康造成巨大危害。