枇杷叶多糖提取及其体外抗氧化研究

王燕新，廖圆圆，郭晓农,2，蔡德育

( 1．西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030;2.兰州大学 草地农业科技学院,草地农业生态系统国家重点实验室,甘肃 兰州 730030)

枇杷叶(EriobotryajaponicaThunb)为双子叶植物，又名芦桔叶、杷叶，是我国中草药中的一种药材[1-2].枇杷叶做成的膏状物，具止咳祛痰、祛热润肺的功能，而蒸制枇杷叶取露，可以解暑.近几年，一些实验报道了枇杷叶内有许多已经了解的成分，如皂苷、黄酮类、多糖等物质[3-5].目前对枇杷的研究主要集中在止咳祛痰、抗炎消肿、抗肿瘤等方面，而对于其所含多糖的相关报道较少.有研究表明，多糖可以提高人体免疫力[6]，能够抗肿瘤[7]、抗衰老[8]、抑菌[9].多糖类化合物在生物学各方面都有较高的利用价值和开发潜力.从植物叶片中提取得到的多糖类化合物，已成为全世界关注的热门课题，但还缺乏对多糖成分和药理的深入探究.因此本实验选取枇杷叶作为实验材料，研究其多糖的抗氧化活性.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

95%乙醇，氯仿，无水乙醇，丙酮，正丁烷，三氯甲烷，6.0 mmol/L硫酸亚铁溶液，6.0 mmol/L水杨酸，50.0 mmol/LTris-HCl缓冲液，5.0 mmol/L邻苯三酚溶液，0.2 mol/L磷酸缓冲液(pH6.6)，1%铁氰化钾溶液，0.1%三氯化铁，不同浓度的过氧化氢溶液，15%三氯乙酸，0.67%硫代巴比妥酸.试验试剂均为国产分析纯.

1.2 仪器与设备

加热套，球形烧瓶，冷凝管，旋转蒸发仪，坩埚，水浴锅，离心机，分光光度计，电子天平等.

1.3 方法

1.3.1 枇杷叶的预处理

枇杷叶除去尘土和叶背部毛絮，蒸馏水润洗放入托盘并用60 ℃的烘箱烘烤24 h，粉碎备用.

1.3.2 枇杷叶多糖的粗提

称取50 g枇杷叶原材料粉末，按照料液质量体积比1∶20加入蒸馏水，回流法提取三次，每次2.5 h，合并提取液.旋转蒸发仪蒸发合并的提取液，得到浓缩液500 mL，90 ℃水浴锅中水浴2 h至叶绿素完全析出.滤除叶绿素沉淀后加3倍体积95%乙醇静置48 h进行醇沉(醇沉3次)，使多糖完全沉淀，所得溶液为多糖粗提取物.

1.3.3 枇杷叶多糖的精提

用滤纸过滤上述所得溶液，得到浸膏.将浸膏转入坩埚，沸水浴加热浓缩，即得粗多糖干品，称重，计算得率.将得到的罗布麻粗多糖干品用蒸馏水溶解，通过SevAge法除去蛋白， 再加入3倍体积95%的乙醇，使乙醇最终体积为80%，4 ℃静置24 h.离心后将沉淀备用， 并用95%的乙醇、无水乙醇、丙酮以及乙醚分别对得到的沉淀进行清洗，最后在60 ℃下烘干，即可得到枇杷叶多糖[10].

1.3.4 枇杷叶多糖含量测定1.3.4.1 多糖标准曲线的制备

参照李瑞燕[11]研究方法进行多糖标准曲线的绘制.

1.3.4.2 提取物中多糖含量的测定

准确称取干燥的枇杷叶多糖的粉末约2 mg，配制成0.2、 0.4、 0.6、0.8、 1.0、1.2 mg/mL的溶液,测定样品吸光度值即可反映样品的多糖含量.

1.4 枇杷叶多糖体外抗氧化能力的研究

本实验通过枇杷叶多糖对羟自由基清除作用、超氧自由基的清除作用、还原作用，以及用分光光度法对DPPH自由基清除作用来探究枇杷叶多糖的抗氧化活性作用的强弱，并用维生素C(Vc)作为阳性对照.

1.4.1 样品溶液制备

将枇杷叶多糖先配制成2 mg/mL的起始浓度备用，再将样品及标品Vc依次配成浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL，保鲜膜封口待用，并用标准Vc做阳性对照.

1.4.2 对羟自由基的清除作用[12-13]

取10 mL具塞试管，按顺序加入6 mmol/L FeSO42 mL，6 mmol/L水杨酸2 mL，不同浓度的样品溶液2 mL，最后加6 mmol/LH2O22 mL进行启动反应，37 ℃下反应1 h，在510 nm下测量各浓度的吸光度.以蒸馏水替换样品形成一个空白对照组.以浓度为6 mmol/L的 FeSO4、浓度为6 mmol/L的水杨酸和蒸馏水各2 mL混合形成样品的本底吸收(即不加H2O2).计算羟自由基清除率.

清除率(%) =[A0-(Ax-Ax0)]/A0×100%

上式中的A0为空白对照组的A值，Ax为加入样品后的A值，Ax0为样品本底的A值.

1.4.3 对超氧阴离子自由基的清除作用[14]

取10 mL具塞试管，分别加入50 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.2，含2 mmol/LEDTA-2NA)4.5 mL、5.0 mmol/L邻苯三酚溶液(以10 mmol/L盐酸配制)0.2 mL.之后添加上述的枇杷叶多糖样品1.0 mL，蒸馏水2.5 mL，将其混匀.以体积相等的10 mmol/L的盐酸替换邻苯三酚为空白调零，用相等的去离子水取代样品作为对照组.于25 ℃下放置20 min，在波长为325 nm下检测样品和对照管的A值，每次检测相隔30 s，计算A值(吸光度)在线性范围内跟时间的改变值的关系，多次测量并计算，此步骤操作3次.以Vc阳性作对照组，同种方法也进行3次平行试验，取平均值.然后计算超氧阴离子自由基的清除率.

清除率=(V1-V2)/V1×100%

上式中V1为对照组邻苯三酚的自氧化速率△A/min；V2为样品，管邻苯三酚的自氧化速率△A/min.

1.4.4 还原能力的测定[15]

依次取各样品溶液2 mL，吸取0.2 mol/L的磷酸盐缓冲液(pH 6.6)2 mL后加入1%铁氰化钾2 mL，摇匀后在50 ℃水浴锅中放置20 min，使其充分反应.从水浴锅中拿出后充分混匀加入2 mL的10%三氯乙酸.再用移液枪吸取2 mL的混合溶液，加上2 mL蒸馏水和0.4 mL 的0.1%的三氯化铁于反应管中，反应10 min后，于700 nm波长处测定A值.以Vc作阳性对照，用上述同种方法重复操作.

1.4.5 对DPPH自由基的清除作用

量取2 mL的DPPH溶液，加入2 mL的95%的乙醇，完全混合均匀后测519 nm处的A值.此时的A值为A0.

量取2 mL的DPPH溶液，加入样品溶液2 mL，完全混匀，静置30分钟后，测519 nm处的A值.

清除率=(A0-A)/A0×100%

2 结果与分析

2.1 对羟自由基的清除作用

羟自由基是毒害极强、风险极高的一类活性氧物质.羟自由基可以消灭红细胞，降解DNA及细胞膜、多糖等物质.大部分由羟自由基所导致的不良后果会因加入羟自由基清除剂后大幅度改善.羟自由基的清除率是评判相关药品抗氧化能力不可或缺的依据.探讨羟自由基的清除剂对探究和揭示一些发病原因、致病机理、衰老原理是不可小觑的.在羟自由基清除的反应中，H2O2和铁离子二价状态时接触后会发生芬顿反应，并且可以产生羟自由基，且其活性很高.这个自由基能与水杨酸有效结合，会得到有颜色的化合物.但在这个体系中可添加某些作为清除剂的化合物.这个物质就会与水杨酸发生竞争反应且为良性的，可以降低合成有颜色物质的量.因此，可利用吸光值的变动来评价枇杷叶多糖对羟自由基的清除效力[16].

图1葡萄糖标准曲线 图2对羟自由基的清除作用

由图2可知，随着枇杷叶多糖质量浓度的增加，其对羟自由基的清除也随之加强，同时对照组Vc的清除能力也伴着其质量浓度的加大而增强.最后根据分析得出，在0.2～1.2 mg/mL的质量浓度时，枇杷叶多糖和Vc的变化程度与自由基清除作用都呈弱线性相关.由图中结果可以看出,对羟自由基的清除能力Vc好于枇杷叶多糖.

2.2 对超氧阴离子自由基的清除作用

超氧阴离子是全部自由基的前身，在生物体内的反应中进行氧化还原反应，有2%～5%的氧可能会生成超氧阴离子自由基，且有毒，它的毒作用会导致氧中毒反应.在碱性环境下邻苯三酚能够自氧化并且产生中间产物，然而它却能促使邻苯三酚的自氧化，在实验下可以测得物质对邻苯三酚自氧化的阻碍作用，从而可以表现其对超氧自由基的清除能力.

由图3显示，由于枇杷叶多糖和Vc溶液质量浓度的加大，枇杷叶多糖对超氧自由基的清除率呈显著递增作用，维生素C的清除率也呈上升趋势.从图3可以得出结论：枇杷叶多糖和Vc的变化趋势与自由基清除能力呈线性相关关系，而且Vc的线性相关关系略好于枇杷叶多糖.

2.3 还原能力的测定

反应的还原效果可以用抗氧化剂的抗氧化效果反映出来.它的机理是添加物将铁氰化钾变成了亚铁氰化钾，亚铁氰化钾再与三价铁反应，生成一种物质叫做普鲁士蓝,并在700 nm处测它的A值(吸光度),以此来评估还原力的强弱：A值(吸光值)越高，则显示所加物的还原能力越强.

图3对超氧阴离子自由基的清除作用 图4还原能力的测定

由图4显示，随着质量浓度的加大，枇杷叶多糖和Vc的吸光度值也增大，即其还原的能力也在呈增强趋势.从图4可以得出结论：枇杷叶多糖的还原能力与质量浓度呈线性相关，而且强于Vc的线性相关关系.

2.4 对DPPH自由基的清除作用

DPPH(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical)即1,1-二苯基-2-苦基肼基自由基，由于其分子中存在数个吸引电子的-NO2和苯环的大π键，故氮自由基可以保持稳定.当清除掉体系中的DPPH自由基时，其在519 nm处的A值就会下降.DPPH作为稳定的自由基，可用来检测清除自由基活性的情况，能够提供理想而简单的药理模型.

由图5结果可知，枇杷叶多糖对DPPH自由基的清除率在质量浓度为0.2～1.2 mg/mL时，随着枇杷叶多糖溶液浓度和Vc溶液浓度的增加，其清除率逐渐增加，呈现弱线性关系.可见枇杷叶多糖和Vc对DPPH自由基表现出较好的清除效果，而且Vc溶液对DPPH的清除率在1.0 mg/mL处达到99.5%.枇杷叶多糖对DPPH自由基清除能力略弱于Vc溶液.

图5 对DPPH自由基的清除作用

2.5 讨论

本次实验以Vc为对照组，从四个方面对枇杷叶多糖的抗氧化能力进行评价，从所得结论的折线图可以看出枇杷叶多糖都有着较为显著的抗氧化活性，而且枇杷叶多糖的浓度越大，效果越明显.变化程度与羟自由基清除效果，超氧阴离子的清除效果，还原能力以及对 DPPH自由基的清除能力都呈线性相关.在还原能力的测定中表现出枇杷叶多糖高于Vc，但是对超氧阴离子、羟自由基和DPPH自由基的清除能力均表现为枇杷叶多糖略低于Vc.通过实验得到的数据做出折线图后分析得到：枇杷叶多糖是一种含一定的抗氧化能力物质，而且其抗氧化的作用呈弱线性关系.Vc是一种具有较强抗氧化能力的抗氧化剂，可以作为自由基清除剂.

3 结论

通过水提法所得枇杷叶多糖提取率为6.43%.其体外抗氧化活性的研究表明，羟自由基的清除率、超氧阴离子自由基清除率以及DPPH的自由基的清除率均随枇杷叶多糖浓度的增加而增加，最高清除率分别为59.4%、62%、73.9%，说明枇杷叶多糖具有良好的抗氧化活性，有较强的自由基清除能力，还具有一定的抗氧化能力.