悬浮培养型BHK-21细胞生长特性及成瘤性研究

赵彩红，王美皓，臧荣鑫，乔自林，马忠仁，，王家敏，

(1.西北民族大学 生物医学研究中心 甘肃省动物细胞技术创新中心，甘肃 兰州 730030;2.西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030)

幼年叙利亚仓鼠肾细胞(Baby Hamster Syrian Kidney，BHK-21)由Macpherson IA[1]等人于1961年从1日龄的仓鼠肾脏中获取并建系，主要用于大规模生产兽用疫苗等生物制品，如口蹄疫疫苗和狂犬疫苗[2]，同时日本乙型脑炎病毒[3]、寨卡病毒[4]以及特定的流感病毒株如A/WSN/ 33 [H1N1](WSN)[5]等也可在该细胞中增殖.因此，该细胞可广泛应用于病毒的分离和增殖.

早期用于口蹄疫疫苗生产的BHK-21细胞是贴壁依赖性细胞，该工艺较为繁琐，生产成本高[6]，运用单个细胞悬浮在不含血清的培养基中生长增殖的无血清全悬浮培养方式已成为工业化培养哺乳细胞生产疫苗的必然趋势[7].悬浮培养模式能克服贴壁培养型细胞生长贴附面积的限制，实现高密度增殖，提高了细胞产量[8].同时,还能取代极具不稳定性、价格又昂贵的血清成分[9]，降低了生产成本，简化了下游加工工艺[10]，使产品质量得到有效控制.目前，已有诸多细胞[11-13]实现了全悬浮无血清培养，使得细胞得到最大程度的利用.研究表明，BHK-21细胞系易悬浮培养[14,15]，其适宜大规模培养[16].但细胞成瘤性是限制细胞生产应用的主要因素之一.

细胞的成瘤性是指将完整的活细胞注入裸鼠、仓鼠或新生小鼠中能形成进行性肿瘤的过程.作为疫苗生产的细胞基质，BHK-21悬浮细胞成瘤性一直备受关注.驯化的悬浮培养型BHK-21细胞的生长特性以及成瘤性也未见报道.我们前期对贴壁型BHK-21细胞进行了驯化，获得了悬浮培养的BHK-21细胞[17].本研究旨在对驯化后的悬浮培养和贴壁培养的BHK-21细胞进行细胞形态、生长动力学和成瘤性的比较研究，确定悬浮培养方式对BHK-21细胞生长特性和成瘤性的影响，以期为疫苗等生物制品生产提供可靠的细胞基质.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

裸鼠BALB/c-nu/nu(雌性)，4～6周，体重21～23 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司.

1.1.2 细胞

贴壁培养型BHK-21细胞，购自ATCC，编号CCL-10，代次P53；悬浮培养型BHK-21细胞，由甘肃省动物细胞工程技术研究中心对CCL-10驯化得到[17]；HELA和KMB-17细胞，由甘肃省动物细胞工程技术研究中心提供.

1.1.3 试剂

DMEM、MEM(Gibco)，BHK-21-SFM培养基、0.25%胰蛋白酶(兰州百灵生物技术有限公司)，NBS(兰州民海生物工程有限公司).

1.1.4 仪器

CO2培养箱(Thermo，3111型 )、倒置相差显微镜(Olympus，CK40-32PH型)、CASY快速细胞活力分析仪(德国ALIT).

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

常规法复苏HELA细胞、KMB17细胞以及贴壁培养型BHK-21细胞于T25方瓶内培养，常规法复苏悬浮培养型BHK-21细胞于T125摇瓶内培养.其中HELA细胞采用添加10%NBS的DMEM培养基培养，KMB17细胞以及贴壁培养型BHK-21细胞添加了10%NBS的MEM培养基培养，悬浮培养型BHK-21细胞采用BHK-21-SFM培养基进行培养.待贴壁细胞长成致密单层后按1∶4比例传代，悬浮培养型BHK-21细胞待生长至4.0～6.0×106/mL时可按5.0×105/mL传代培养.将复苏后第3、4代的贴壁培养型BHK-21细胞以及悬浮培养型BHK-21细胞分别进行生长动力学和裸鼠体内成瘤性试验.

1.2.2 细胞形态观察

细胞培养过程中，观察贴壁培养型BHK-21细胞以及驯化后的悬浮培养型BHK-21细胞的状态，进行拍照，并做好记录.

1.2.3 细胞生长曲线绘制

取复苏后适应培养第3代的贴壁培养型BHK-21细胞，用胰酶消化后制成单细胞悬液，计数并稀释成1.0×104/mL.将稀释好的细胞悬液接种到24孔板内，置于37 ℃，5%CO2培养箱中培养.每隔24 h，取3孔消化计数，直至细胞密度降低为止.同理，将复苏适应后第3代的悬浮培养型BHK-21细胞，稀释成50.0×104/mL，接种到150 mL摇瓶中，培养体积为40 mL.绘制贴壁培养型BHK-21细胞以及悬浮培养型BHK-21细胞生长曲线，并求细胞最大増殖密度以及倍增时间(PDT).

1.2.4 裸鼠成瘤试验1.2.4.1 细胞悬液制备

取培养至对数生长期的HELA细胞(阳性对照细胞)、KMB17细胞(阴性对照细胞)、以及复苏后适应培养第4代的贴壁培养型BHK-21细胞，采用胰酶消化法并以1 000 rpm离心5～10 min收集细胞，而驯化后的悬浮培养型BHK-21细胞则直接离心收集细胞.将收集的4组细胞均采用PBS重悬制备注射用细胞悬液，细胞浓度调整至5×107cells/mL.

1.2.4.2 裸鼠接种与观察

裸鼠接种试验分组见表1，共接种40只裸鼠.采用裸鼠背部皮下注射的接种方式，每只接种细胞悬液0.2 mL.将贴壁培养的BHK-21细胞与驯化后悬浮培养的BHK-21细胞接种至裸鼠皮下，观察贴壁培养型与驯化后的悬浮培养型的BHK-21细胞对裸鼠成瘤能力的影响.同时在裸鼠皮下注入阴性对照细胞与阳性对照细胞，以确定造模是否成功.接种后SPF级环境下继续饲养裸鼠，之后每2天记录裸鼠体重，并用游标卡尺测量瘤体积[瘤体长(a)、宽(b)，肿瘤体积=(a×b2)/2]，同时绘制裸鼠瘤体积生长曲线图，观察裸鼠活动情况，并记录存活情况.

1.2.4.3 统计学处理

2 结果

2.1 细胞形态观察

贴壁培养型BHK-21细胞为成纤维样细胞，形态整齐、大小均一、边缘清晰(图1，A).而驯化后的BHK-21悬浮细胞为圆形细胞，细胞均质透明、大小均一、细胞均匀分散，无明显结团现象(图1，B).

A.BHK-21 贴壁细胞(48 h，10×) B.BHK-21 悬浮细胞(48 h，10×)

图2 贴壁和悬浮培养型BHK-21细胞生长曲线

2.2 细胞生长特性

贴壁培养型与驯化后的悬浮培养型BHK-21细胞生长曲线如图 2 所示，均呈典型的“S”型.如图2所示，贴壁培养型BHK-21细胞的最大增殖密度为39.67×104/mL，细胞群体倍增时间为23.03 h；悬浮培养型BHK-21细胞的最大增殖密度为517×104/mL,与贴壁培养型BHK-21细胞的最大增殖浓度具有显著差异(P<0.05)，细胞群体倍增时间为21.36 h.

2.3 裸鼠体内成瘤实验结果

2.3.1 接种后裸鼠状况统计

统计各实验组裸鼠活动情况、存活情况，并对成瘤情况进行统计(表 1).绘制生存函数曲线(图3).接种贴壁组的裸鼠在观察期内存活良好，活动正常，而悬浮组的裸鼠，其活动异常，在第六日便有裸鼠出现精神萎靡不振、采食量低，甚至死亡.如图3所示，裸鼠接种BHK-21悬浮细胞后，其生存率低于贴壁组.

表1裸鼠接种后记录

图3 不同细胞接种后裸鼠生存函数曲线

2.3.2 不同培养方式对裸鼠成瘤能力的影响

如表2所示，接种阴性对照组细胞的裸鼠未形成肿瘤，且裸鼠存活良好；接种阳性对照组细胞的裸鼠肿瘤形成率达到100%，表明造模成功.

同时，将贴壁组以及悬浮组的细胞注入裸鼠皮下后，表现出了不同的裸鼠成瘤能力.本研究发现接种不同细胞后，裸鼠在观察期内其体重是增加的(图4，A)，但悬浮组裸鼠的体重增长率均低于其他三组(图4，B)(P>0.05).同时，接种悬浮组的裸鼠成瘤体积增长率高于其他三组(图4，C)，其最终瘤体积也与阳性组和贴壁组的裸鼠最终瘤体积存在显著差异(图4，D)(P<0.05).

3 讨论

幼仓鼠肾(BHK-21)细胞已成功建立了传代细胞系，目前已用于生产各类病毒性疾病的兽用疫苗，如口蹄疫疫苗[2]等，其在重组蛋白[18,19]等方面也有研究.现如今，为了获得高效高产的生物制品，细胞作为至关重要的媒介，在如何提高增殖密度，简化操作流程等方面已被大量研究[20].同时，在生产人用疫苗等生物制品方面，传代哺乳动物细胞系的安全性始终令人担忧[21].

图4 BHK-21细胞不同培养方式对裸鼠成瘤能力的影响

目前，已有诸多关于贴壁细胞以及悬浮细胞生长特性的研究.悬浮培养工艺不仅弥补了贴壁培养产量低的不足，更降低了企业的生产成本，对疫苗产业的下游纯化技术降低了要求[10].贴壁细胞与悬浮细胞相比，其培养方式不仅发生了改变，细胞结构也发生变化[22,23].本研究将贴壁培养型BHK-21细胞和驯化后的悬浮培养型BHK-21细胞进行了生长特性的比较研究，发现驯化后的悬浮培养型BHK-21细胞在同样的培养体积下其最大增殖密度远高于贴壁细胞.同时其BHK-21悬浮细胞的倍增时间也比贴壁细胞短.表明悬浮培养BHK-21细胞能够提高细胞产量，同时悬浮培养方式还可以简化操作流程，节省了成本.乔自林[17]等人将此株驯化后的BHK-21悬浮细胞在5 L生物反应器上进行培养，分别采用了流加培养方式和批培养方式，其最大增殖密度以及倍增时间均比本研究好，其可能存在的原因是生物反应器能更精准地控制培养过程中的DO、pH等参数，使得细胞能在最佳的培养条件下生长.

细胞的成瘤性使得该细胞作为生产疫苗等生物制品的细胞基质的可能性大大减小，因为它可能诱导宿主产生肿瘤，也可能将自身携带的肿瘤进行同质异体传递，对宿主机体产生很大损伤[24].对于哺乳动物生产的疫苗是否安全，多家医药机构进行了严谨的验证.研究发现,将完整的MDCK活细胞注入裸鼠后会形成进行性肿瘤[25-27].郝鹏[28]等人也采用降血清的方式,获得细胞倍增时间约35 h的悬浮培养型MDBK细胞.Liu J[29]等人通过单克隆法筛选出了低成瘤性的MDCK细胞，刘鑫莹[13]等人也用同样的方式获得需添加1%血清的悬浮培养的ST细胞，这些均表明能增加病毒产量，但细胞的成瘤性并未明确化，因此还需进行摸索.于义娟[30]等人也对悬浮培养的BHK-21细胞进行了裸鼠敏感性实验，发现接种低于《中华兽药典》要求的细胞量，即103个细胞也能使裸鼠成瘤.因此，筛选低成瘤性或无成瘤性的BHK-21细胞势在必行.

4 结论

本研究将贴壁型的BHK-21细胞以及由该细胞驯化而来的悬浮培养型的BHK-21细胞接种至裸鼠背部皮下，发现采用低血清方式驯化得到的BHK-21悬浮细胞，其成瘤率与贴壁型的BHK-21一致，但其悬浮型的BHK-21细胞其成瘤体积更大，对裸鼠的机能损坏更为严重.因此，采用低血清驯化获得BHK-21悬浮细胞的方式还有待改善，对得到的BHK-21细胞还需进一步探索，以降低其成瘤性，提高生物制品的生物安全性.