孔雀石绿适配体生物传感器的研究进展

丰敏,杜宁,张洋子,李相阳,许文涛*,刘海燕*

1.华北理工大学公共卫生学院,河北 唐山 063210；2.中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083；3.北京农学院食品科学与工程学院,北京 102206

孔雀石绿(malachite green，MG)又称为苯胺绿、盐基块绿、中国绿、碱基绿，是一种人工合成的三苯甲烷类染料，分子式为C23H25N2Cl，属于小分子物质[1-3]。MG本身的荧光量子产率极低，被认为是一种无荧光物质。但当MG与孔雀石绿适配体(malachite green aptamer，MGA)结合时，荧光强度显著增加[4]。MG的结构由1个中心碳原子连接的3个苯环组成，结构灵活，3个苯环之间可自由旋转，其中，不含二甲氨基取代基的环(C环)被认为是影响MG发挥作用的核心基团。需要注意的是，MG的化学官能团三苯甲烷及N,N-二甲基苯胺均为具有毒性的致癌物质。在酵母细胞和人类卵巢细胞中，MG的限制浓度为0.1～1 μmol/L[5]。

适配体可将目标物包封在其结合口袋内，是一段能与目标物高特异性、高亲和性结合的短链DNA或RNA片段。适配体具有与抗体相似的识别行为，但其空间结构与抗体相比更为灵活，可通过自身结构的变化来调节功能，其中具有荧光特性的适配体可用作荧光探针。传统的荧光探针需要在核酸上标记荧光基团、淬灭基团，若淬灭基团未将荧光基团完全淬灭，会导致荧光背景值较高[6]。与传统的荧光探针相比，荧光适配体是一种典型的无需标记的荧光检测探针，荧光染料能够与相应的适配体结合形成配体络合物，从而显著增强荧光信号。研究表明，在适配体的存在下，荧光染料的荧光强度能增加3个数量级[7]。因此，MGA作为一种典型的荧光适配体，具有潜在的应用价值。

本文根据近年来MGA的研究成果综述了MG RNA适配体及其变构体和MG DNA适配体的特性、研究现状，以及影响MG-MGA复合物荧光强度的因素。同时，还对MG的衍生物和共聚物的特性进行了总结。最后，综述了MGA在生物传感、荧光成像等领域的应用，以期更好地明确MGA在生物检测、生物成像等领域的发展方向。

1 MG RNA适配体

1.1 筛选与表征

MG RNA适配体的筛选主要依靠指数富集进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)，即在体外含有随机序列的分子池中选择可与靶物质高亲和性结合的核酸序列，通过MG诱导适配体发生构象变化，MG被包裹在适配体内，形成配体络合物，并不断的对配体络合物进行PCR扩增、富集、测序等过程，最终将单个核酸从文库中筛选出来。1990年，Ellington和Szostak[8]第一次通过SELEX技术体外筛选获得适配体；1999年，Grate和Wilson[9]通过SELEX技术筛选出MGA，这是设计无标签荧光团探针的第一步。研究发现，MG与其RNA适配体结合，可以使自身的荧光强度增加2 000多倍[7]。

MG RNA适配体与配体的亲和力可以通过等温滴定量热法(isothermal titration calorimetry，ITC)、核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)光谱[10]、荧光滴定法、平衡透析法和X-射线晶体学[11]等方式进行表征，其中常用的表征方式为ITC、NMR光谱、荧光滴定法。ITC是一种通过添加不同的结合成分而导致热力学变化的技术，即通过添加MGA产生MG-MGA复合物，从而引起热力学参数结合常数(Ka)、焓变(ΔH)、熵变(ΔS)发生变化。MG RNA适配体自适应结合的一个显著特点是未结合配体的适配体口袋中不含可检测结构，因此可以通过NMR光谱测定适配体结合口袋中的碱基配对模式，通过比较碱基配对的模式来判断适配体的结合情况[12]。荧光滴定法是通过向MG溶液中加入MGA，再通过检测MGA加入后的荧光变化来实现对于MGA的结合常数的表征。

1.2 性质

MG RNA适配体是一段含有38个碱基的核苷酸序列，它有2种密切相关的配体：MG和TMR(tetramethylrosamine)。TMR是一种常规的线粒体荧光染料，它可在MG的2个含有二甲氨基的苯环中间插入醚键，从而使MG结构的刚性增强[13]。MG RNA适配体依赖于堆积和静电相互作用与配体识别，再通过配体诱导、适配体自适应的方式与MG结合。RNA适配体与配体的结合部位是RNA适配体的结合口袋，结合口袋与配体的结合主要是通过质子的驱动发挥作用[14]。MG RNA适配体的结合口袋由1个基本的四重结构(C7，G24，G29，A31)和1个Watson-Crick碱基对(G8，C28)组成，两侧的A9与A30关闭了口袋的另一侧[15]。除1个U32碱基外，所有的内环核苷酸都参与了结合口袋的形成，结合口袋碱基的堆积导致两侧形成双螺旋的茎部结构[11]。而配体的存在使得RNA内部碱基互补配对和堆积，导致RNA适配体结合口袋中的电荷分布发生变化[16]。

1.3 MG RNA适配体的变构体

MG RNA适配体的筛选已较为成熟，被广泛应用于生物传感器中，但RNA适配体合成成本高、不稳定、易被核酸酶降解。因此，对MG RNA适配体进行劈裂、裁剪等对于提高其稳定性具有重要的作用。

1.3.1MG RNA劈裂适配体 劈裂适配体是将原适配体劈裂成2个或者多个短片段而形成的核酸探针[17]。经过劈裂的核酸片段不具有特定的空间构象，因此无特异性背景信号。而当靶物质存在时，靶物质可使劈裂适配体的空间构象发生变化，形成劈裂适配体-靶物质复合物，进而使得荧光强度增加。利用劈裂适配体进行检测，可在提高检测的灵敏度和特异性的同时降低背景信号，此外，部分劈裂适配体经劈裂后长度缩短，降低了合成成本[18]。

MG RNA适配体是典型的带有“三通道”的二级结构，在进行劈裂的时候，首先去除适配体的环状结构，然后对茎上的非结合位点部分的互补序列进行裁剪，减少茎区域的碱基数量[19]。Kolpashchikov团队[20]将38 nt的MGA劈裂成2个部分，其中一条链长为10 nt，另一段链长为16 nt，劈裂适配体的碱基数比原适配体碱基数减少了12 nt，同时，劈裂适配体减少了与配体结合中不必要的空间位阻，节约了合成成本。而且，劈裂的核酸适配体与靶标仍然具有高亲和力和高效的识别能力，并降低了与靶标类物的亲和力，提高了特异性检测靶标的能力。

1.3.2MG RNA截短适配体 截短适配体是对已经筛选得到的适配体进行裁剪得到的较短的适配体。目前，在研究中得到了一段碱基数为27 nt且与MG的结合能力较强的MG RNA截短适配体，它的碱基序列为5′-UCCCGACUGGAACAGGUAACGAAUGGA-3′[6,21-22]。2009年，Xu和Lu[6]将MG RNA截短适配体与ATP的适配体串联，成功实现对于ATP的检测。2019年，Zhao等[21]利用一种基于MG RNA截短适配体结合金纳米粒子构建的生物传感器来检测MG，该生物传感器的灵敏度较高，检测限达到1.8 nmol/L。

1.3.3其他 为了克服RNA适配体易降解的弊端，2019年，Luo等[23]提出将一种创新的L-型MG RNA适配体应用于MG的检测，L-型适配体的结构是普通适配体结构的镜像对称体，研究表明，这种L-型适配体对靶物质的识别能力和亲和力与普通适配体类似，但这种适配体的稳定性显著高于普通适配体，其在缓冲液中21 d内不会发生降解，具有较强的抗酶水解的能力。研究人员将这种L-型MG RNA适配体用于MG的检测，检测限可达到47.7 nmol/L。

1.4 MG-MG RNA适配体复合物荧光强度的影响因素

影响MG-MGA复合物荧光强度的因素较多，其中pH、阳离子浓度、温度以及有机溶剂对MG-MGA复合物荧光强度的影响是目前研究的重点[24]。目前，常使用Tris缓冲液与HEPES缓冲液作为MG与其RNA适配体的结合环境。又由于MG RNA适配体是在HEPES缓冲液中筛选出来的，因此，对于MG-MGA复合物荧光强度的影响因素的研究主要基于HEPES缓冲液[6,9,24]。

1.4.1pH 当RNA适配体暴露于碱液时，适配体会被永久降解，因而，碱性条件会使MG-MGA复合物的荧光信号减弱。当pH大于9时，RNA发生变性，适配体结合域的结构被破坏，导致MG-MGA复合物解离，荧光信号减弱；当恢复到最适pH时，荧光仍无法恢复。当pH为5～9时，MG与其RNA适配体的结合有明显的荧光信号；当pH为6.5～7时，荧光信号最佳[24]。

1.4.2阳离子 RNA适配体本身带负电，因此，MG与其RNA适配体的结合需要一定的阳离子环境，而结合环境中阳离子的种类及含量对MG-MGA复合物的形成及其荧光特性至关重要。二价阳离子Mg2+和一价阳离子K+、Na+是各种缓冲液中常见的阳离子，也是对RNA的折叠有显著影响的阳离子。这些阳离子具有封闭的电子层结构，如K+、Mg2+可通过静电力与RNA相互作用；且这2种离子的半径与离子-RNA复合物的形成有着密切关系，一方面离子的半径决定了给定螯合位点的空间配位，另一方面离子的半径越小，电荷密度越大，水合能越大[6,24]。K+、Mg2+的存在被认为是MG-MGA复合物形成的必要条件，如Mg2+的浓度在5～10 mmol/L范围内是荧光信号增强与稳定的最佳条件，荧光强度能保持30 min[24]。研究表明，二价阳离子不存在时，RNA适配体的结合口袋中不存在碱基互补配对，缺乏三级结构。由此可见，二价阳离子对于三级结构的维持极为重要[16]。而K+、Na+在稳定MG-MGA复合物的性能方面作用相当，它们都对复合物的形成至关重要，因此，结合环境中存在K+或者Na+是必要的，研究表明，Na+能增加MG-MGA复合物的荧光强度[24]。

1.4.3温度 MG-MGA复合物的形成和稳定性都受到温度的影响。当MG与其RNA适配体在0 ℃孵育时，复合物的荧光信号较弱；当孵育温度为35 ℃时，复合物较难形成；当孵育温度调整为4～8 ℃时，荧光强度最大且荧光信号最稳定，但达到荧光强度最大值的时间较长(需要几天的时间)，不能满足快速检测的需要。当MG与其RNA适配体孵育温度为16～20 ℃时，荧光强度在16 min时达到最大值，且荧光信号稳定(约维持1周)。因此，16～20 ℃为MG与其RNA适配体孵育的最佳温度[24]。

1.4.4有机溶剂 有机溶剂对MG-MGA复合物的荧光强度有着不同程度的抑制作用，其中含氢键的有机溶剂对荧光强度的抑制作用相对较弱；此外，有机溶剂对MG-MGA复合物的荧光信号有一定的稳定作用，且能减少MG-MGA复合物Kd值的变化[24-25]。在羟基存在的情况下，羟基通过攻击MG的中心碳(C1)将MG漂白，而MG RNA适配体的存在可抑制漂白作用，这种抑制作用主要是因为MG RNA适配体可与MG结合形成MG-MGA复合物，从而在空间上将羟基排除，使其不能与MG的中心碳(C1)结合；当存在MG RNA适配体的反义互补寡核苷酸链时，漂白作用可逆转，可以通过MG RNA适配体与反义互补链调节位阻，从而控制MG的分子反应活性[26]。而选用纯水做MG与其RNA适配体的结合缓冲液的溶剂时，MG-MGA复合物的荧光效果最佳[24]。

2 MG DNA适配体

目前，对于MG DNA适配体的研究较少，MG能与部分DNA(主要为G-四联体结构)结合增强荧光信号。当G-四联体作为MG DNA适配体时，MG的3个苯环通过末端叠加的方式加在G-四联体的2个外部四分体上，但G-四联体结构可以与多种小分子染料结合并增强它们的荧光信号，因此，基于G-四联体与MG的复合物构建的生物传感器无法满足高特异性的需求[27]。

2016年，Wang等[27]通过利用目标诱导DNA适配体释放的SELEX方法进行扩增、纯化、筛选，得到1种仅含有26 nt碱基的MG DNA适配体。当该适配体遇到MG时，它含有的带有11个碱基的结合口袋能将小分子MG包裹在内，使MG的荧光信号增强几倍到几十倍。该适配体的Kd值为2.43±0.39 μmol/L，这种荧光适配体的激发波长为617 nm，发射波长为650 nm。

3 MG的衍生物及共聚物

MG可通过与MGA结合显示出良好的荧光特性，但MG具有一定的毒性，在一定程度上影响了MGA生物传感器的应用。结晶紫(crystal violet，CV)、TMR、派洛宁Y(Pyronin Y，PY)等都被证明是MGA的结合配体[12,16]，只有了解它们的特性，才能更好地发挥MGA的优势。

CV是MG的衍生物，CV与MG结构的区别为CV的3个苯环上都含有二甲氨基取代基。但CV与G-四联体的复合物荧光微弱，无法区分G-四联体与其他DNA，也没有表现出优先与G-四联体结合的特性[31]。经荧光光谱分析，CV的吸收波长不随G-四联体浓度的增加而变化，且吸收峰的增加缓慢，这主要是由于CV的3个苯环上都含有二甲氨基取代基，阻碍了G-四联体中CV的插入结合[29]。

MG、TMR与MGA结合的亲和力高于CV、PY，但TMR无论是单独存在还是与MG的RNA适配体结合后都能呈现荧光，而CV只有在与MG的RNA适配体结合形成复合物的情况下才能形成荧光。4种配体与MG RNA适配体的结合速率为PY>TMR>MG>CV，Mg2+的加入使得适配体结合配体的速率变慢，但是结合的稳定性增加[12]。值得一提的是，PY浓度过高时会产生毒性。当PY的浓度为1.7～3.3 μmol/L时，PY主要分布在线粒体中，无细胞毒性，但能抑制细胞的生长，阻碍细胞进入G1期；当PY的浓度为6.7～33 μmol/L时，PY呈现细胞毒性，分布于细胞核和细胞质中，PY能诱导G2期联体和S期细胞停滞[32]。

表1 MG DNA适配体与MG RNA适配体的比较Table 1 Comparison of MG DNA aptamer and MG RNA aptamer

此外，孔雀石绿吲哚酰基衍生物(indolyl derivatives，IMG)是在MG的结构基础上将MG的A环与B环上的各1个甲基分别替换为乙基而形成的衍生物。IMG的吸收波长为632 nm，荧光量子产率约为MG的2倍；当存在MGA时，IMG的吸收波长红移到650 nm，荧光量子产率增加且大于MG-MGA复合物的荧光强度[7]。

聚乙烯醇(poly vinyl alcohol，PVA)与MG形成的MG-聚乙烯醇共聚物(PVAMG)是一种中性的聚合物。研究表明，这种聚合物具有光诱导荧光信号增强的特性，经光照射，这种聚合物含有的带阳离子的芳香环能为平行的G-四联体结构提供结合位点，MG可以堆积在G-四联体的最外层，从而使荧光信号显著增强。而且PVAMG与平行G-四联体结合的亲和力比与非平行G-四联体结构结合的亲和力强，但在黑暗条件下，PVAMG与G-四联体没有亲和力，荧光信号微弱；无论在黑暗条件下还是在光照条件下，PVAMG均无细胞毒性[33]。

4 MGA的应用

目前，MGA主要应用于生物检测领域，利用MG与MGA结合的高亲和力和荧光特性，可以实现对于MG及其他靶物质的检测。由于MG具有一定的毒性，利用MGA实现生物体内的检测及体内荧光成像的研究较少。

4.1 荧光生物传感器

MGA作为一种性能良好的荧光适配体具有广泛的应用前景，MGA既可以作为信号识别元件识别靶物质MG，又能通过MG-MGA复合物的荧光特性实现荧光信号输出。

2010年，Stead等[24]利用固相萃取技术结合MGA构建了一种快速检测鱼类组织中MG的荧光检测方法。在该研究中，MGA既作为信号识别元件识别鱼类组织中的MG，同时又作为信号输出元件将MG与MGA的结合信号转化为荧光信号，从而实现荧光信号的输出。此研究是MGA用于食品检测的首次报道，该方法的特异性好，检测周期短，一般在4 h内可以完成对20个样品的检测。

2009年，Xu和Lu[6]构建了一种基于MG-MGA复合物的荧光信号实现ATP检测的生物传感器，该团队将ATP适配体与MGA偶联，又添加了1条能与ATP适配体和MGA相邻部分互补的桥连探针。体系中始终存在MG，当体系中不存在ATP时，桥连探针与ATP适配体结合在一起，无法将MGA打开，体系无荧光；当体系中存在ATP时，ATP与其适配体结合并将桥连链撬开，MG可以与MGA结合并发生构象变化，荧光信号显著增强。因此，可以通过荧光信号的强弱实现ATP的定量检测。该荧光生物传感器借助MGA实现荧光信号输出，无需荧光标记，通用性强，可用其他适配体代替ATP适配体实现靶物质的检测。

4.2 电化学生物传感器

MGA具有高特异性识别配体的能力，且与MG的亲和力高，因此，MGA可以作为MG的信号识别元件用于MG的检测。2014年，王虹智等[34]构建了一种夹心结构的电化学生物传感器，在修饰电极的表面固定能特异性识别并捕获MG的适配体，当被检测物质中含有MG时，适配体捕获MG并将MG固定在电极表面，再接上含有辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)的MG抗体，HRP能分解H2O2产生电化学信号，从而构建了一种可以特异性识别水产品中MG的电化学生物传感器。MGA在该生物传感器中作为信号识别元件，特异性识别被检物质中的MG，该生物传感器成本低、灵敏度高、操作简单、分析快速。

4.3 比色生物传感器

基于MGA的比色生物传感器是以MGA作为信号识别探针，通过MG与MGA的结合实现信号的转化，从而实现MG的比色检测。2018年，Jia等[35]构建了基于MGA的比色生物传感器，在该比色生物传感器中，MGA作为靶物质的识别探针，金纳米粒子作为信号输出元件，MGA非特异性吸附在金纳米粒子上并阻止金纳米粒子的高盐聚集。若体系中存在MG，MG可将吸附在金纳米粒子上的MGA剥离，促使金纳米粒子发生聚集，溶液由红色变为蓝色。利用该比色生物传感器可以实现MG的检测，检测限为15.95 nmol/L。该方法便捷、快速，信号的产生简单，可通过肉眼进行鉴别。

2019年，Zhao等[21]构建的基于MGA与金纳米粒子的比色生物传感器，成功用于检测水产养殖用水中的MG。该生物传感器利用MG RNA适配体作为信号识别元件，实现了MG的检测。当MG存在时，MG能与MGA高特异性结合，使CTAB+-RNA适配体的结构解离，CTAB+释放，CTAB+可以吸附在柠檬酸盐封装的金纳米粒子表面，使金纳米粒子聚集，抑制金纳米粒子的纳米酶活性，从而抑制金纳米粒子对3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine，TMB)的催化活性，使原体系的蓝色变浅。因此，可以根据体系颜色的变化比色测定MG的含量，该比色生物传感器的检测限为1.8 nmol/L。

4.4 荧光成像

将MGA应用于体内研究需要考虑MG的毒性。有研究表明，当MG浓度低于10 μmol/L时，对大肠杆菌的生存没有任何影响[5]。2018年，Yerramilli和Kim[36]提出了一种利用MGA进行荧光成像的新策略。研究人员将MGA作为荧光探针用于检测细胞中的RNA，他们将6个MGA串联以增加MGA体系的荧光强度，由于MGA与MG结合呈现远红外荧光，因此，MGA可与多种波长在绿色或者黄色荧光范围的荧光蛋白及适配体联合使用。研究人员利用串联的MGA和诱导型质粒诱导MGA在细菌中表达，结果显示，荧光强度增加了20倍且荧光信号稳定，5 μmol/L的MG加入6 h之后仍可以检测到荧光信号。而且，当串联的MGA与其他荧光mRNA及RNA适配体一起使用时，这种强的MG荧光信号不会被干扰。

5 展望

MGA与配体的结合亲和力高、特异性强，MGA依赖配体诱导结合与自适应结合的方式将MG包裹在结合口袋中并显著增强MG的荧光信号，通过MG与MGA的结合即可实现MG及其他靶物质的荧光检测。MG-MGA生物传感器克服了传统的荧光标记检测中背景信号强的缺陷，方便、快速且检测灵敏度高。

目前，已经筛选得到的MGA数量较少，筛选方式单一，对于MGA的研究主要停留在实验室水平且实际应用较少，无法满足日渐拓宽的检测需求。因此，可以借助更多的筛选方式进行MGA的筛选，得到更多具有优良生物学特性的MGA；同时，也可以通过对MGA进行劈裂、截短，提高其稳定性及环境耐受性，促进MGA更好的应用到实际检测中，为生物传感、荧光成像、疾病诊断等研究领域提供稳定、可靠地检测手段。由于MG的高毒性，MG-MGA生物传感器在体内检测中的应用受到限制，考虑是否可以对MG的结构进行改造，从而产生毒性低且能与MGA高亲和的MG结构衍生物，再通过MG衍生物与MGA的结合来实现靶物质的体内检测。同时，可将MGA与纳米粒子相结合来改变纳米酶的活性，从而调控纳米酶的催化活性，拓宽纳米酶的催化范围，实现高灵敏度的靶物质检测。此外，MGA还可以通过一定的扩增手段形成水凝胶并进入水生生物的细胞内，实现对于水生生物体内MG含量的检测。