气体生物传感器的应用研究进展

粟元,李舒婷,许文涛,2*

1.中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京食品营养与人类健康高精尖创新中心,北京 100083；2.中国农业大学,农业农村部转基因生物食用安全重点实验室(北京),北京 100083

生物传感器种类多样，是基于物理、化学、生物的高新技术，在各行各业中被广泛应用。生物传感器具有许多优点，如对多种靶标选择性好、灵敏度高、检测时间短等。近年来，气体生物传感器渐渐走进人们视野，它是一类输出信号为气体的生物传感器，主要利用酶实现气体信号的转化，其设计方式多样，输出方式简单，检测速度快，气体从无到有，从而使得背景值较低。

目前，气体生物传感器多是将识别信号转化为颜色从而实现对各种靶物质如microRNA、癌细胞、端粒酶等的检测，气体信号表征方式较单一，且应用范围有一定限制。粟元等[1]在前文中综述了气体生物传感器识别机制的相关研究进展。本文将从气体信号输出的角度出发，介绍不同气体生物传感器的优缺点，这有利于搭建不同种类的气体生物传感器；然后分类阐述蛋白酶介导的气体生物传感器、核酸酶介导的气体生物传感器、模拟酶介导的气体生物传感器和其他气体生物传感器的原理和应用，这有利于总结除颜色以外的信号表征输出方式，如气体浓度、气压和pH；最后，对气体生物传感器的检测手段和应用前景提出了展望。

1 气体生物传感器

表1 多种气体生物传感器的对比Table 1 Comparison of different type of gas biosensors

2 气体生物传感器的应用

目前，气体生物传感器的应用主要集中在利用蛋白酶、核酸酶、模拟酶，以实现对细菌、miRNA生物标志物、毒素、塑化剂等靶物质的检测，利用生物细胞和生化反应搭建体系的研究较少。

2.1 蛋白酶介导的气体生物传感器

2.1.1脲酶(urease)脲酶是由植物、真菌和细菌产生的一种含镍酶，它催化尿素水解成氨和氨基甲酸酯。脲酶在生物化学中具有重要的历史意义，它是第一个被结晶的酶。目前，有研究利用脲酶水解尿素产生氨气，使溶液pH变化，建立pH与靶物质的浓度间的关系从而实现对靶物质的检测，该传感器应用于实际样品的检测，结果令人满意。如Chen等[2]在黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，AFB1)抗原上标记脲酶，靶标与脲酶标记的AFB1抗原竞争，被抗体捕获。脲酶可催化尿素水解生成氨，诱导溶液pH升高，使用手持式pH计或pH敏感染料可以轻松检测到变化。在优化条件下，pH的增强与AFB1浓度的对数在0.62～23.42之间呈线性关系。图1显示了基于竞争性酶联免疫吸附试验的AFB1生物传感器的工作原理。另外，也有研究利用氨分子与银离子间的作用使体系颜色发生变化，建立颜色与靶物质的浓度间的关系从而实现对靶物质的检测，该传感器检测限较低。Pei等[3]设计了用标记脲酶的OTA作为竞争抗原将尿素水解成氨，在氨分子存在下，银离子被葡萄糖中的甲酰基还原，在金纳米花(33 nm，AuNFs)表面生成银壳，溶液的颜色由蓝色变为棕红色。

2.1.2辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)1976年，Welinder等[4]首次确定了HRP-C是一组单亚基糖蛋白，是一种以亚铁血红素为氧化还原中心的过氧化物酶，之后其被广泛地应用在废水处理、食品工业、有机合成和分析检测等领域。目前，研究主要利用HRP催化体系产生的气体与3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine，TMB)之间的作用产生颜色变化这一原理设计传感器检测靶物质。如Wang等[5]将HRP与羧基官能化碳纳米管共价偶联，体系中的H2O2可进一步氧化TMB底物，得到比色产物。Zhu等[6]设计了基于HRP的用于检测痕量邻苯二甲酸二丁酯(din-butyl phthalate，DBP)的比色免疫传感器，利用Cu(II)还原为Cu(I)，从而抑制HRP催化无色TMB氧化成蓝色TMB。

2.1.3过氧化氢酶(catalase,CAT)目前，研究主要利用过氧化氢酶能够与底物过氧化氢作用产生气体这一原理开发生物传感器，也有研究将过氧化氢酶制备成膜与其他物质结合增强催化性能。如Seetharamaiah等[7]提出了一种利用金属离子配位组装技术在石墨电极上制备的一维金纳米结构和CAT多层膜的电化学生物传感器。Mohd[8]研究了基于过氧化氢酶标记抗体的常规ELISA程序，即酶消耗过氧化氢，并通过添加金(III)氯化物进一步产生金纳米粒子，溶液中残留的过氧化氢的量决定了金纳米粒子溶液是呈现蓝色还是呈现红色。

图1 基于竞争性酶联免疫吸附试验的AFB1生物传感器的工作原理[2]Fig.1 Working principle of AFB1 biosensor based on competitive enzyme-linked immunosorbent test[2]

2.2 核酸酶介导的气体生物传感器

G-四链体(G-quadruplexes)是一种特殊的DNA结构，是由富G核酸序列中4个鸟嘌呤(guanine,G)两两间形成2个霍氏氢键围成的正方片层堆叠而成[9]。氯高铁血红素(hemin)作为相互作用剂，通过直接堆积或嵌入G-四链体形成氯化血红素/G-四链体(hGQ)而与分子内G-四链体结构相互作用[10]。

目前，许多研究利用氯化血红素/G-四链体作为新型催化剂，催化过氧化氢产生氧气，并与TMB、ABTS等物质结合，使体系颜色发生变化，从而开发了各种生物传感器。Zhang等[11]采用等温比色法扩增检测转基因生物中的CaMV 35S启动子序列。在体系中，G-四链体与Hemin形成具有过氧化物酶活性的DNA酶，催化H2O2介导的生色酶底物2,2′-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐离子[2,2′-diazo-bis(3-ethyl benzothiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt ion，ABTS2-]的氧化导致绿色产物的形成。

2.3 模拟酶介导的气体生物传感器

2.3.1纳米酶 各种纳米材料，如贵金属纳米颗粒、碳基纳米颗粒、金属氧化物纳米颗粒、金属硫化物纳米颗粒、复合纳米颗粒，已经发现具有拟过氧化物酶活性，研究集中在通过纳米酶催化底物TMB、ABTS产生有色物质实现可视化检测或检测体系气体压力，由此设计不同气体生物传感器实现对不同靶物质的定量检测。

纳米酶分为基于非金属纳米材料的纳米酶和基于金属纳米材料的纳米酶。基于非金属纳米材料的纳米酶常见的如碳纳米材料。Hayat等[12]提出了具有类过氧化物酶活性的在碳纳米管(carbon nano tube,CNT)表面上掺入氧化锌纳米颗粒(ZnO)的纳米复合材料。

全国政协常委、副秘书长、新教育发起人朱永新在主旨演讲中指出，公私合作、民办学校的分类管理及小微学校的合法化是当前体制改革的热点；国家教育发展研究中心教育体制改革研究室主任王烽对当前深化办学体制改革的几个关键问题进行了解读；北京师范大学教授曾晓东和台湾振铎学会理事长丁志仁分别就美国的“择校”现象及台湾实验教育的立法与实践等话题与参会者进行了深入探讨。

基于金属纳米材料的纳米酶包括金纳米粒子、铂纳米粒子、铜纳米粒子和Fe3O4磁纳米粒子。金纳米粒子(AuNPs)的过氧化物酶样活性遵循Michaelis-Menten动力学模型，并且依赖于环境pH和温度，这与HRP非常相似。与HRP不同的是AuNPs的活性非常高，即使H2O2浓度比HRP低两个数量级，AuNPs只需要较低H2O2浓度在很窄范围内也能达到最大反应速率并避免酶中毒[13]。Ding等[14]制备了三元金属杂化纳米粒子(FePt-Au HNPs)，其具有优异的过氧化物酶活性。Shi等[15]用磁珠(MB)和铂纳米颗粒(PtNPs)催化H2O2产生大量的O2，通过检测气体压力值测定靶标。这比之前的许多报告更敏感。Liu等[16]通过将目标响应水凝胶与压力计读数相结合，当靶物质存在时，刺激水凝胶反应允许释放预载的PtNPs，将H2O2分解为O2。然后，在密封环境中产生的O2导致显著的压力增加，这可以通过手持式压力计容易地读出。使用这种基于目标的水凝胶压力测定，可以实现便携式和高灵敏度的可卡因、赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)和铅离子检测，具有出色的准确度和选择性，图2显示了其原理。Borghei等[17]开发了一种基于DNA模板化铜纳米团簇(DNA-CuNCs)的过氧化物酶，通过它可以构建简便、廉价、快速的比色法。Chen等[18]制备了具有类过氧化物酶作用的Fe3O4纳米纤维，并建立了检测L-半胱氨酸的敏感平台，对L-半胱氨酸的选择性优于其他氨基酸、葡萄糖和金属离子。

关于这几种材料所结合的方法、原理和检测限的比较如表2所示，虽然检测的靶标不一致，但所构建的原理可以参考，并根据该方法可以结合当前各材料的应用优势进行优化并超越。

表2 不同纳米材料模拟酶的比较Table 2 Comparison of different nanomaterials mimic enzymes

2.3.2金属有机骨架(metal-organic frameworks，MOFs)金属有机骨架是一类由金属离子或簇与有机连接基团在相对温和的条件下自组装形成的混合材料[19]。MOFs 属于一种新兴的结晶分子功能材料，具有很多特性，其中包括：超高的孔隙率、优异的结构可调性、巨大的内部表面积、结构多样性、高的化学稳定性和强大的热稳定性等[20-21]，同时还具有催化活性[22]。

目前，主要利用MOFs的类过氧化物酶活性与底物过氧化氢作用设计开发气体生物传感器。Qi等[23]设计并制造了一种能够为过氧化氢的催化反应发出荧光的PA-Tb-Cu MOF纳米酶。Li等[24]合成了柱状多金属氧酸盐金属有机骨架[Cu5(pz)6Cl][SiW12O40] (CuSiW12)。值得注意的是其类过氧化物酶活性优于原硅钨酸，且体系具有灵敏度高、线性范围宽、检测下限低、对H2O2的响应时间快(2 min)等特点。

2.3.3小分子物质 荧光素是一类小分子物质，因其多功能的荧光特性，在医学、生物成像和生物传感等领域得到了广泛的应用。荧光素介导的气体生物传感器的应用主要集中在利用它们的拟过氧化物酶性能，其功能与天然氧化酶相同。与HRP相比，荧光素对TMB表现出更高的亲和力，主要通过与显色底物如TMB、邻苯二胺(o-phenylenediamine，OPD)和ABTS作用发生颜色变化实现对靶物质的检测。Li等[25]研究了2′,7′-二氟荧光素(2′,7′-difluorofluorescein，DFF)的过氧化物酶样活性，其可以催化H2O2氧化TMB以产生蓝色氧化产物。值得注意的是，DFF显示出比荧光素和2′,7′-二氯荧光素(2′,7′-dichlorofluorescein，DCF)更高的过氧化物酶样活性。

2.4 生物细胞介导的气体生物传感器

目前，利用生物细胞构建酶基因表达催化底物产生气体的生物传感器很少，具有催化活性的生物细胞较多。Liu等[26]发现芽孢杆菌脲酶(BpUrease)是一种有前景的生物催化剂。由此可设计用特定变体有效降解模型黄酒中的尿素和乳油产生气体。Ripolles[27]研究开发了过氧化物生物检测器，评估了一系列过氧化氢酶阳性细菌：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、单核细胞增生李斯特氏菌、铜绿假单胞菌、肠沙门氏菌。形成生物膜的所有过氧化氢酶阳性食源性病原体均在生物检测器的检测中显示阳性，检测到的最小微生物负荷为104CFU/cm2，最强烈的阳性反应是铜绿假单胞菌。利用生物细胞表达基因或直接催化底物产生气体，设计开发气体生物传感器用于检测靶物质具有广阔前景。

2.5 生化反应介导的气体生物传感器

对于生物体，体内体外都存在许多产生气体的生化反应，例如三羧酸循环产氧和二氧化碳，水果、酒、泡菜、面团发酵产生香味，垃圾贮存产生氨气、硫化氢等。在一定情况下，可根据产气情况对食品质量进行分析控制。然而，目前利用生化反应构建的生物传感器比较罕见。

通过将靶物质与催化产生气体的物质相连接，构建气体生物传感器，随着反应的进行，反应速率升高或降低存在动态变化，能够构建相关性关系，进而实现对靶物质的检测，且不需使用高效液相色谱仪等大型仪器来检测气体信号。

图2 靶向响应水凝胶压力法的工作原理[16]Fig.2 Working principle of target response hydrogel pressure method[16]

3 展望

本文结合生物技术和化学技术，介绍了通过酶搭建的气体生物传感器，分类综述了气体生物传感器的应用，总结了当下利用气体生物传感器方法的检测现状，目前气体生物传感器在功能核酸检测领域的应用还较少且比较单一，而关于结合生物技术和气体浓度分析检测靶物质的研究还未见报道，这种新的信号策略将为简单、便携、高灵敏度分析检测靶物质开辟一条新途径。

近年来，食品安全问题层出不穷，食品检测技术仍旧面临着巨大的挑战，每年都会有新产品进入市场，因此对食品的检测和安全性评价至关重要，基于气体生物传感器的检测方法在多方面都有很广阔的发展前景。

3.1 检测设备的智能化、稳定化

气体浓度和压力的测量没有光学或磁场噪声，气体浓度仪和气压计对气体敏感，检测速度快，未来可以设计能与手机相连接的检测设备，通过手机就能够智能控制、监测和分析；气体容易散失，有些气体易溶于水，可以根据气体的不同性质设计气体发生装置收集气体，使检测结果能够更加稳定、准确、可靠。

3.2 模拟酶种类增加

近年来，人工模拟酶成本低廉、稳定性高、催化活性高、易于储存，且能有效降低干扰物的影响，未来可以设计更多方式方法开发制备种类多样、高效催化的人工酶，还可以将纳米材料、金属有机骨架等性能优良的不同材料复合使用，对比筛选出高效模拟酶使其应用更加广泛。

3.3 检测方法的通用性、均向性

利用酶催化底物取代传统的化学催化或物理反应，反应过程副产物较少，且简化了工艺、节省了设备、降低了危险且减少了污染等，反应体系的信号识别、信号转化、信号输出的一体化形成了循环放大，能够实现对更多靶物质的均向检测，未来可以增加气体生物传感器的通用性。

3.4 检测领域的扩大以及多重检测

总体而言，基于上述原理可开发制备大量更高效、更多元、更完善的气体生物传感器，同时检测对象可进一步扩大，如应用于转基因、重金属、违法添加物质、生物标志物、生物毒素、病原微生物等靶标物质的检测，未来气体生物传感器的利用潜力非常大，且检测领域极为广泛。

另外，气体生物传感器具有识别单一或复杂成分气味的能力，当一种靶物质对应一种气体时可以实现精准定量检测；当反应体系产生几种气体时，可以同时检测多种靶物质，或者将气体信号分子与荧光信号分子、电化学信号分子等结合，实现对多重靶标物质的检测，这对食品安全和核酸检测研究具有重大的意义。