miR-525及其靶基因ZNF395对胎儿发育的影响及其作用机制

曹文红,靳 钰,卜令真

(青岛市妇女儿童医院产科,青岛 266000)

胎儿生长受限(fetal growth restriction,FGR)指足月分娩的新生儿体质量低于2.5 kg,或新生儿体质量不足同期新生儿体质量平均值的90%[1]。FGR为新生儿严重并发症之一,发病率为5%-10%,为引起新生儿死亡的主要因素之一,也可导致FGR新生儿患病率较正常体质量新生儿高4-6倍[2]。FGR除对新生儿的生长发育存在一定影响,还可对大脑及心血管等系统发育造成不利影响[3]。导致胎儿生长受限的因素较多,如:胎盘、环境因素、遗传因素等,因此对于FGR发病机制的研究一直以来为妇产科研究的热点问题。胎盘为母婴营养交换的唯一场所,功能异常时,可导致母婴营养交换异常,影响胎儿发育。目前学界多认为胎儿发育受限受胎盘缺氧影响,但导致胎盘发育或激素分泌异常及缺氧机制尚未明确。有研究认为可能与孕期疾病、母体心血管功能异常等因素导致胎儿无法获得充足能量。胎盘发育早期受滋养细胞和血管形成影响[4,5],且已明确滋养细胞侵入及异常迁移可引起胎盘发育受限,降低母婴血液交换,抑制胎儿的生长发育。上述研究均证实血管形成异常在FGR发病中具有重要的作用,但导致血管形成异常机制尚未明确。

miRNA为分子量为21-24个核苷酸的非编码RNA,在促进细胞增殖、分化及基因调控等方面具有重要的作用[6]。近些年有研究对孕妇血液中的多种miRNAs含量进行检测,结果表明其含量随着妊娠时间增加不断提高,但未发现这些miRNAs与子痫或FGR存在相关性[7]。但现阶段对于FGR中miRNAs的研究还较为局限,对于胎盘或血浆中miRNA表达的研究还较少。孕期低氧环境可上调miR-525表达,从而导致胎盘血管形成异常,引起母婴氧气及营养物质交换功能异常,抑制胎儿正常发育[8]。因此,本研究探讨miR-525及其靶基因ZNF395对FGR发生的影响及作用机制,为FGR的防治提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

随机选取2018-01～2018-12我院妇产科收治的30例胎儿生长受限(fetal growth restriction,FGR)新生儿胎盘组织为观察组,选择同期收治的30例正常体质量新生儿胎盘组织为对照组。FGR诊断标准[1]:足月分娩的新生儿体质量低于2.5 kg,或新生儿体质量不足同期新生儿体质量平均值的90%,或妊娠37周时胎儿体质量低于2.5 kg。对照组诊断标准:以《妇产科学》相关诊断标准为参考依据，2.5 kg<足月新生儿体质量<4 kg。纳入标准:均为单胎妊娠,胎儿无先天性病变,无内分泌或遗传性或其他系统疾病。两组新生儿Apgar评分均≥7分。两组新生儿一般资料见表1。所有纳入新生儿家属知情同意且签署知情同意书;本研究已获取我院伦理委员会批准同意。

表1 两组新生儿一般临床资料对比(n=30)

Table 1 Comparison of general clinical data of newborns between the two groups(n=30)

组别年龄(岁)孕周(周)新生儿体质量(g)观察组28.85±3.3939.21±1.692163.99±338.98对照组27.91±3.5139.47±1.563420.79±261.30t1.0550.61916.084P0.1480.269 0.000

1.2 主要试剂

microRNA提取试剂盒、microRNA逆转录试剂盒、microRNA实时定量PCR(Taqman法)、miR-525及内参U6反转录及PCR引物、ZNF395及内参GAPDH反转录及PCR引物(购自于美国Sigma公司)、蛋白提取试剂(购自于碧云天生物技术公司)、考马斯亮蓝法蛋白测定试剂盒(上海索宝生物科技有限公司)、GAPDH抗体(AG019-1)、二抗:辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG(购自于碧云天生物技术公司)、ZNF395抗体(购自于圣克鲁斯生物技术有限公司)。

1.3 标本采集

两组产妇自然分娩后,取胎盘母面中央大小约为1 cm3组织,置于-80 ℃冰箱中保存备用。

1.4 指标检测

采用microRNA提取试剂盒提取胎盘组织中的总RNA,随后采用microRNA逆转录试剂盒将总RNA逆转录为cDNA,再采用real time-PCR对胎盘组织中的miR-525水平及内参U6表达相对值进行检测。

采用real time-PCR对胎盘组织中ZNF395水平及GAPDH表达相对值进行检测。采用Western blotting对ZNF395蛋白转录水平进行检测,内参为GAPDH。

以上操作均严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 两组胎盘组织miR-525表达水平对比

溶解曲线显示本研究中内参基因U6和miR-525 RCP扩增无其他杂质,且Ct值内逆转录产物含量与循环次数为指数关系,且尚未到达平台期,可对目标产物进行定量检测。结果见图1。

采用RT-PCR法对两组胎盘组织中的miR-525水平进行检测,结果显示,FGR组胎盘组织中的miR-525表达水平明显高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05,见图2)。

2.2 两组胎盘组织miR-525靶基因ZNF395表达水平对比

溶解曲线显示本研究中内参基因GAPDH和靶基因ZNF395 RCP扩增无其他杂质,且Ct值内逆转录产物含量与循环次数为指数关系,且尚未到达平台期,可对目标产物进行定量检测。结果见图3。

采用RT-PCR法及Western bloting法对两组胎盘组织中ZNF395蛋白转录水平进行检测,结果显示,观察组胎盘组织中ZNF395 mRNA水平明显低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05,见图4,5)。

2.3 miR-525和靶基因ZNF395相关性分析

Spearman相关性分析,结果表明,miR-525和ZNF395表达水平存在负相关关系(r=-0.666,P=0.001,见图6)。

图3 ZNF395及内参GAPDH溶解与扩增曲线

图4 RT-PCR法检测miR-525靶基因ZNF395表达水平

图5 Western bloting法检测miR-525靶基因ZNF395表达水平对比

图6 FGR组胎盘组织miR-525和靶基因ZNF395表达相关性分析

3 讨论

国外有学者对合并FGR孕产妇血浆中部分miRNA(miR-525、miR-517、miR-526a等)分析发现[7],随着妊娠的不断增加,这一类miRNAs含量也随之不断增加,表明miRNAs表达水平增加与FGR发生可能具有一定的相关性,而miRNAs具有作为诊断FGR的潜在标志物的潜力;而在FGR孕妇胎盘组织中总miRNAs含量较正常妊娠孕妇明显降低,由于在滋养细胞生长中miRNAs具有调控其靶基因的作用,从而影响FGR的发生。有学者对孕妇胎盘组织中的miRNAs进行分析[9],发现miRNAs与胎儿发育受限相关。Mouillet等[10]通过对正常妊娠产妇和合并FGR产妇血浆部分缺氧miRNAs含量进行检测,发现两组研究对象每种miRNAs含量无差异,但合并FGR组血浆缺氧相关miRNAs含量为正常妊娠产妇的1.8倍,则表明血浆miRNAs含量增加可能与FGR具有相关性;与此同时,研究通过对比正常妊娠产妇和合并FGR产妇胎盘组织中的miRNAs含量,对总miRNAs表达水平对比中发现,合并FGR孕妇表达水平相比于正常妊娠孕妇低24%,但每种miRNAs含量无差异性。由上述研究可知,胎盘组织中的miRNAs的表达差异可能与FGR的发生具有一定的相关性,其机制可能为miRNA通过对其靶基因进行调节从而影响胎盘特别是滋养层细胞的生长。

但现阶段对于miRNA与FGR相关性的研究较为局限,还需要进一步的深入研究。有研究表明[11,12],miR-525、miR-424、miR205等在胎盘组织中存在特异性表达。其中,miR-16、miR-21等的异常表达对胎儿生长受限具有重要的作用[13,14]。而对于miR-525的研究中发现[8],miR-525受缺氧调控,若机体处于缺氧状态时,表达水平增加从而调控血管的形成。近些年来,在肝细胞癌研究中,miR-525通过介导靶基因ZNF395参与肝癌的发生发展,具有抑制血管生成的作用[15]。ZNF395是Kruppel C2H2型锌指蛋白家族的成员之一,其在机体中表达较为广泛,最初被鉴定为调节人乳头瘤病毒(HPV)表达的转录因子(HPV-binding factor,PBF),具有与HPV启动子区域结合的作用[15]。在缺氧条件下,ZNF395可在血管中大量表达,具有促进血管形成的作用[16]。Tsukahara等[17]发现ZNF395为肿瘤相关抗原物质之一。且ZNF395也被证明具有通过激活caspase-3促进细胞凋亡来调节PI3K/Akt通路以抑制细胞生长的作用[18-20]。但现阶段尚未见到关于ZNF395在FGR发生发展中作用机制的报道。因此推测miR-525可能具有调控血管生成的作用。而胎盘血管形成异常则为引起胎儿发育受限的重要因素,因此miR-525可能对于胎儿的发育具有重要的影响作用。

本研究结果发现,合并FGR孕妇胎盘组织中miR-525的表达水平较正常妊娠孕妇增加,而其靶基因ZNF395表达水平则降低。对miR-525和其靶基因ZNF395进行Spearman相关性分析表明,miR-525和靶基因ZNF395存在负相关关系(r=-0.666,P=0.001)。因此,推测miR-525可能通过抑制靶基因ZNF395的表达,抑制胎盘尤其是滋养细胞的发育,从而引起胎儿发育受限。

综上所述,在生长受限胎儿胎盘组织中miR-525表达增加,靶基因ZNF395表达降低,miR-525通过介导靶基因ZNF395表达水平影响胎儿的发育。