基于调控网络构建的食管鳞状细胞癌放疗抵抗核心miRNA/mRNA鉴定

黄 珊,王亚利,王中卫,白明华,郭 亚,马红兵

(西安交通大学第二附属医院肿瘤放疗科,西安 710004;*通讯作者,E-mail:huangshan2164@126.com)

食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)是我国高发恶性肿瘤,放疗是局部晚期患者主要治疗手段,可提高肿瘤局控率和患者生存。但仍存在部分患者对放疗抵抗,导致治疗失败。microRNA(miRNA)是一类21-25个核苷酸的非编码RNA,在转录水平调控mRNA。临床及基础研究显示,多种miRNA及其靶mRNA与食管癌放疗敏感性关系密切[1],前期证实miRNA-21通过靶向PTEN调控PI3K/Akt通路干扰ESCC放疗敏感性,抑制miRNA-21可以提高ESCC细胞放射敏感性[2]。同时,研究报道多种基因可参与促进ESCC放疗抵抗[1]。miRNA与靶mRNA构成了一个复杂的miRNA-mRNA调控网络,全面分析ESCC放疗抵抗机制,鉴定核心miRNA及mRNA具有重要意义。癌症基因图谱(the cancer genome atlas,TCGA)数据库提供高通量的RNA数据,同时存有临床治疗及预后数据。本文利用TCGA数据库中的食管癌数据,运用生物信息学方法,分析获得放疗抵抗相关miRNA及mRNA,构建ESCC放疗抵抗miRNA-mRNA调控网络,进一步鉴定及验证放疗抵抗核心miRNA及mRNA。

1 材料与方法

1.1 患者及样本

使用R语言中的TCGAbiolinks包从TCGA数据库(https://cancergenome.nih.gov/)中下载183例食管癌“TCGA-ESCA”中的mRNA、miRNA和临床数据集,对数据进行去重、整理和转换。根据临床数据集选取病理类型为鳞状细胞癌且行放疗的病例,以变量“measure of response”作为放疗反应评价指标,“complete response”为敏感组,“radiographic progression disease”为抵抗组。

1.2 差异表达分析

使用R语言edgeR包对比两组数据,获得差异表达mRNA(DE mRNA)和差异表达miRNA(DE miRNA),False Discovery Rate(FDR)<0.05和|log2 Fold Change|>1作为阈值。

1.3 DE mRNA富集分析

使用R语言clusterProfiler包对DE mRNA进行GO功能注释和KEGG通路富集分析。使用GO数据集对DE mRNA进行包括生物过程(biological process,BP)、细胞组成(cellular component,CC)和分子功能(molecular function,MF)三个方面的富集分析。

1.4 蛋白-蛋白相互作用网络构建与分析

使用STRING(https://string-db.org/)在线预测DE mRNA在蛋白质水平的作用关系,使用Cytoscape绘制蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction network,PPI)网络。使用Cytoscape增强包MCODE在构建的PPI网络中进行聚类,构建功能模块(Module),选取MCODE score≥4.8,获得PPI网络中紧密联系的区域。

1.5 ESCC放疗抵抗miRNA-mRNA网络构建及核心mRNA/miRNA鉴定

采用miRWalk3.0(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de)在线预测DE miRNA的靶mRNA,比较DE mRNA与DE miRNA的靶mRNA,获得候选靶mRNA,分析候选靶mRNA及miRNA之间调控关系,Cytoscape绘制miRNA-mRNA网络。采用Cytoscape中的cytoHubba插件MMC法分析获得的PPI网络的拓扑结构,对候选miRNA及mRNA进行进一步分析,最终获得核心mRNA及miRNA[3]。

1.6 放疗抵抗食管鳞癌细胞构建及验证

通过连续辐射法构建放射抵抗TE-1及Eca-109细胞,分别命名为TE-R及Eca-R,采用克隆形成实验验证细胞放射抵抗性。TE-R及Eca-R构建及克隆形成实验方法同既往发表文章[2]。Elekta Synergy直线加速器以250 cGy/min的剂量率用2 Gy X射线照射处理指数生长期的细胞,后培养、传代细胞。待细胞生长至50%密度时,给予第二次照射后继续培养。继续分次照射直至总剂量达到60 Gy,并在后续实验前至少培养四代。克隆形成试验检测细胞放射敏感性,将细胞以每孔100-7 000个的密度接种于六孔板中,24 h后置于直线加速器下照射,后置于培养箱继续培养10-14 d。待细胞形成克隆后固定并染色,计数由50个或更多细胞组成的细胞克隆,计算不同剂量下细胞存活分数(SF)。在GraphPad Prism 7.0软件中,运用单击多靶模型SF=1-(1-e-KD)N拟合细胞存活曲线并计算放射生物学参数。采用t检验比较两组放射生物学参数,比较放射敏感性差异。P<0.05为差异具有统计学意义。

1.7 实时定量PCR

提取细胞总RNA并测定其浓度、纯度及完整性。取无菌无RNA酶的EP管作为反应管,在反应管中加入模版RNA,特异性引物,无RNA酶水混匀,置于PCR仪上进行扩增。扩增结束后去除反应管,再加入反转录试剂后进行反转录获得cDNA。收集cDNA,按照说明书(20 μl反应体系)加入灭菌的八联管中,后置于PCR仪中,设定程序后开始循环。循环结束后Bio-Rad CFX Manager软件采集数据,相对Ct法分析目的miRNA或mRNA表达量。进一步计算放射抵抗细胞与其亲本细胞内miRNA或mRNA表达量比值,获得在TE-1、Eca-109两种食管鳞状细胞癌细胞系中均升高或降低2倍以上的miRNA或mRNA。

1.8 统计学处理

所有数据表示为平均值±标准差,采用t检验对比差异,P<0.05为差异具有统计学意义。采用R 3.5.1软件行统计学分析,采用GraphPad Prism 7.0软件绘图。

2 结果

2.1 确定ESCC放疗抵抗DE mRNA和DE miRNA

通过R包“edgeR”对比敏感组和抵抗组肿瘤样本,获得548个DE mRNA,其中抵抗组122个下调、426个上调(DE mRNA热图见图1,DE mRNA火山图见图2);获得5个DE miRNA(miRNA-375,miRNA-137,miRNA-873,miRNA-1468和miRNA-1293),均在抵抗组上调,DE miRNA火山图见图3，DE miRNA名称及其P值见表1。

蓝色代表放疗抵抗组(resistance),红色代表敏感组(sensitive)

使用R包gplots绘制,X轴表示食管鳞癌放疗抵抗组和敏感组癌组织样本间mRNA的平均表达差异,Y轴表示错误发现率(false discovery rate,FDR);红色和绿色点分别表示差异表达显著的上调和下调mRNA

2.2 DE mRNA的GO和KEGG富集分析

GO BP分析显示DE mRNA显著富集于核小体组装、染色体组装或分解以及DNA构象变化;GO CC分析显示DEGs主要富集在核小体、DNA包装复合物及蛋白质-DNA复合物;GO MF分析显示DE mRNA主要与核小体DNA结合及金属内肽酶活性的分子功能有关;KEGG通路分析显示DE mRNA主要富集在IL-17信号通路(见图4)。

使用R包gplots绘制,X轴表示食管鳞癌放疗抵抗组和敏感组癌组织样本间miRNA的平均表达差异,Y轴表示错误发现率(false discovery rate,FDR);红色和绿色点分别表示差异表达显著的上调和下调mRNA

表1 食管鳞状细胞癌放疗抵抗组肿瘤差异表达miRNA

Table 1 Differential expression of miRNAs in radioresistance esophageal squamous cell tumor samples compared to radiosensitive group

miRNA名称P∗差异表达 hsa-miRNA-3750.00000121上调 hsa-miRNA-1370.00006200上调 hsa-miRNA-8730.00007860上调 hsa-miRNA-14680.00028200上调 hsa-miRNA-12930.00028400上调

*P值为与放疗敏感组比较,放疗抵抗组食管鳞状细胞肿瘤样本中miRNA的差异表达

2.3 PPI网络构建与分析

DE mRNA的PPI网络由192种蛋白质相互作用构成(见图5)。确定了4个模块(见表2),模块1由19个节点和161个边组成,包括HIST1H2BF、HIST1H2AE、HIST1H3B、HIST1H2BA、HIST1H2AD等,主要为核小体组装。模块2包括10个节点和33个边缘,包括ARHGEF25、ANXA1、CXCR2、FPR2、LPAR6等,主要位于G蛋白偶联受体信号通路。模块3包括5个节点和10个边缘,包括KRT9、KRT10、KRT2、KRT33B和KRT83,主要位于角化细胞死亡过程。模块4由6个节点和12个边组成,包括GATAD1、RBM48、ANKIB1、CCDC132、FAM133B和SAMD9L,均位于均染色体7q21扩增子。

图4 放疗抵抗差异mRNA的GO聚类分析

图5 蛋白-蛋白相互作用网络及模块分析

表2 蛋白-蛋白相互作用各模块包含蛋白详情

Table 2 Protein details of each module in protein-protein interaction(PPI)module analysis

模块蛋白数量蛋白名称 Module 119HIST1H2BF、HIST1H2AE、HIST1H1C、HIST1H1D、HIST1H1A、HIST1H2BE、HIST1H3D、HIST1H4K、HIST1H2AJ、HIST1H3H、HIST1H3B、HIST1H2BG、HIST1H4D、HIST1H3G、HIST1H2BL、HIST1H2BM、HIST1H2BA、HIST1H2BI、HIST1H2ADModule 210ARHGEF25、ANXA1、CXCR2、FPR2、LPAR6、PPBP、NMU、NTSR1、ADCY8、CXCL5Module 35KRT9、KRT10、KRT2、KRT33B、KRT83Module 46GATAD1、RBM48、ANKIB1、CCDC132、FAM133B、SAMD9L

2.4 放疗抵抗miRNA-mRNA网络

放疗抵抗DE miRNA的下游靶mRNA与DE mRNA进行组合分析,获得42个候选mRNA,采用Cytoscape软件进行可视化,获得放疗抵抗miRNA-mRNA调控网络(图6)。进一步使用cytoHubba插件MMC法[3]对构建的miRNA-mRNA网络中的miRNA再次分析,发现网络中miRNA-137与mRNA关联度较低被剔除。最终获得4个放疗抵抗核心miRNA(miR-1293、miR-873、miR-375及miR-1468)和5个核心mRNA(ZDHHC22、IGFBP5、ADAM23、NTNG1和DCC),见图6。

红色代表核心miRNA,绿色代表核心mRNA

2.5 核心miRNA及mRNA的细胞学验证

构建食管鳞癌放疗抵抗细胞TE-R及Eca-109R细胞,细胞存活曲线显示,TE-R细胞的肩部较TE-1细胞更宽,Eca-R细胞的肩部较Eca-109更宽,TE-R及Eca-R细胞的放射抵抗性明显高于其亲本细胞TE-1及Eca-109(P<0.01,见图7)。检测上述核心miRNA及mRNA在放疗抵抗TE-R及Eca-R中表达量,miR-1293及miR-375在两种食管鳞癌放疗抵抗细胞中均明显高表达(P<0.01),IGFBP5及ADAM23在两种食管鳞癌放疗抵抗细胞中均明显低表达(P<0.05,见图8)。

3 讨论

临床研究显示,ESCC肿瘤组织及患者血清中miRNA表达水平与放疗反应相关[1,4]。体外机制研究表明,miRNA及下游靶mRNA可通过干预DNA损伤修复、细胞周期、细胞凋亡、细胞自噬及肿瘤干细胞等机制,调控ESCC放疗敏感性[5]。本研究利用TCGA数据库筛选放疗抵抗DE miRNA及DE mRNA,进一步通过构建ESCC放疗抵抗miRNA-mRNA调控网络、鉴定核心miRNA及mRNA,最后在放射抵抗细胞中进行验证。

采用单击多靶模型SF=1-(1-e＾[-KD])＾N拟合细胞存活曲线并对比两组细胞放射敏感性差异;构建的放射抵抗细胞TE-R及Eca-R的放射抵抗性均高于其亲本细胞,P<0.01

A.TE-1细胞系 B.Eca-109细胞系

本研究通过生物信息学分析后获得4个放疗抵抗核心miRNA(miR-1293、miR-873、miR-375及miR-1468),其中仅miR-873在一项研究中报道与ESCC对新辅助化疗的反应有关[6]。Niwa等[6]发现血清miR-873在新辅助化疗有反应患者中高表达,而本研究的结果显示放疗有反应患者肿瘤组织中miR-873较无反应者中低表达,此差异可能与放化疗治疗方式、miRNA检测取材部位不同有关。miRNA-1468与食管癌的关系尚无报道,但其已被证实与肺腺癌、肾乳头状细胞癌的预后有关[7,8],miRNA-1468可通过激活人肝细胞癌中PPAR-γ介导的AKT信号传导来促进肿瘤进展[9]。进一步,我们对上述4个由生物信息学鉴定获得的核心miRNA进行了细胞学验证,miR-375、miR-1293在两种放射抵抗细胞中均高表达。既往在食管癌中的研究,尚无miR-375、miR-1293与食管癌放疗敏感性关系的报道,仅Luo等[10]通过荟萃分析提示,miR-375在食管癌组织较正常组织中表达有差异,且与食管癌患者总生存间存在关系。但在直肠癌中,Campayo等[11]报道肿瘤组织中过表达miR-375患者的新辅助放化疗反应较差。本研究在食管癌中发现miR-375在放疗反应较差患者(抵抗组)的肿瘤组织及放射抵抗细胞中均过表达,该结果与Campayo等[11]的报道一致。既往研究显示miR-1293与肺癌患者预后密切相关[12,13],但其与食管癌患者放疗反应及预后的关系尚无报道,可能是一种新的放射抵抗miRNA,值得深入研究。

本研究通过生物信息学并结合细胞验证,发现IGFBP5及ADAM23与食管鳞癌放疗抵抗组织及细胞中均明显低表达。IGFBP5,即人胰岛素样生长因子结合蛋白5,是人类发现的IGFBPs同源蛋白家族之一。研究报道,IGFBP5抑制是ESCC细胞获得顺铂耐药的机制之一,通过增加IGFBP5的表达水平可以逆转顺铂抗性表型[14]。但是,IGFBP5与食管癌放疗敏感性的关系目前尚无报道。ADAM23基因的失活与人类肿瘤发生有关,但亦无其在食管癌放疗敏感性中的研究。目前研究显示,ADAM23低表达与较差的上皮性卵巢癌存活率相关[15],ADAM23在非小细胞肺癌中低表达,且其下调可能通过启动子甲基化促进非小细胞肺癌的进展[16]。本文利用生物信息学从TCGA数据库中筛选出潜在的差异mRNA,并结合miRNA-mRNA调控网络及细胞学验证,提示IGFBP5、ADAM23可能成为增强ESCC放疗敏感性的潜在靶点。

本研究还对放疗抵抗差异mRNA进行了基因及蛋白聚类分析,结果显示放疗抵抗组中高表达的差异mRNA与核小体组装有关。既往报道组蛋白修饰在DNA损伤修复过程中发挥作用[17],提示放疗抵抗相关mRNA可能通过提高辐射后细胞DNA修复而促进放疗抵抗。同时,本文的研究还发现染色体7q21中7个基因在放疗抵抗组中高表达,研究报道7q21扩增与食管癌预后直接相关,CDK6在食管癌中驱动7q21扩增[5],提示抑制CDK6可能是提高食管癌放疗敏感性的潜在靶点[18]。

本研究表明,基于食管癌肿瘤样本及疗效评价构建miRNA-mRNA网络以鉴定放疗抵抗核心miRNA及mRNA具有一定可行性。今后还需要扩大样本量和实验研究,以开发新的放疗抵抗干预靶点。