肝纤维化形成过程中血清ROS和GSH的水平变化

董亚芬,申风俊

(山西医科大学第一临床医学院消化科,太原 030001;*通讯作者,E-mail:919016603@qq.com)

肝纤维化是由各种急慢性肝脏损伤所导致的,以细胞外基质在肝组织间质过度沉积、降解减少所引起的一种病理改变,大量研究发现氧化应激在肝脏疾病的发生发展中起着重要作用[1]。活性氧簇(ROS)如超氧阴离子、过氧化氢或羟基自由基,是由先天免疫系统的吞噬细胞“呼吸爆发”产生的,作为抵御入侵病原体的第一防御机制,是通过健康的肝脏产生几种酶和非酶抗氧化系统来解毒的。但在肝脏疾病期间,这些抗氧化系统会变得枯竭,加剧肝脏炎症[2],同时ROS在促进自噬激活过程中起关键作用,因此抗氧化剂可显著减少ROS的产生,阻止肝星状细胞(HSC)活化过程中的自噬体和自噬通量的产生,从而起到抗纤维化的作用[3],因此抑制ROS介导的纤维生成可能产生巨大潜在的治疗益处[4]。我们已知还原性谷胱甘肽(GSH)是主要的细胞抗氧化剂之一,能有效地清除氧自由基,解毒脂质过氧化反应的亲电性产物,并维持蛋白质的巯基状态,增强抗氧化能力,从而减轻肝纤维化[5],恢复氧化应激和抗氧化防御能力之间的平衡或者使其向抗氧化防御能力倾斜,可以保护肝脏免受进一步的损伤,减缓或限制疾病的发展[6]。本实验通过建立四氯化碳(CCl4)诱导的肝纤维化模型,测量肝纤维化形成过程中血清GSH、ROS水平,明确GSH及ROS在肝纤维化形成过程中的意义,以期为临床防治肝纤维化提供新的理论依据与治疗途径。

1 材料与方法

1.1 实验动物与材料

清洁级健康雄性SD大鼠(180-210 g)购于河北医科大学实验动物中心;ROS比色法试剂盒购自上海西唐生物科技有限公司;还原性谷胱甘肽比色法测试盒购于南京建成生物工程研究院;CCl4购自天津市风船化学试剂科技有限公司。

1.2 动物处理

将34只大鼠随机分为2组,其中正常对照组6只,模型组28只,模型组给予皮下注射40% CCl4油剂,1周2次,对照组给予相同剂量油剂皮下注射,直至实验结束。两组大鼠均给予正常饮食。注射CCl4后的第2,4,6,8周各杀死模型组大鼠6只,模型组大鼠在建模5周及7周时各死亡2只,造模失败,8周杀死对照组大鼠6只,留取血清及肝组织备用。

1.3 临床病例

收集正常健康对照及乙肝肝硬化患者各20例,入选者禁食12-14 h,于晨起空腹采肘静脉血5 ml注入试管中,4 ℃离心(3 000 r/min)分离血清,-80 ℃冰箱内保存待测。正常健康组均为正常健康者并且无肝功能异常,肝炎病毒标志均为阴性。乙肝肝硬化纳入标准:慢性乙型肝炎肝硬化的诊断标准依据《传染病学(第8版)》中的诊断标准,即HBsAg阳性大于6个月,且目前HBsAg和/或HBV DNA仍为阳性,临床表现实验室检查肝组织活检影像学检查证实存在肝硬化。排除标准:①合并其他肝炎病毒感染;②酒精性、药物性、自身免疫等原因引起的肝硬化;③合并有肝脏以外的消化道疾病如感染、腹泻或吸收不良等疾病;④合并肝脏以外的其他脏器功能障碍。

1.4 比色法测定血清中ROS及GSH浓度

血清ROS的检测:①根据ROS说明书配制标准品液;②加样:向每个孔加入20 μl标准品或者待测样品,向每个孔中加入100 μl底物工作液,并向每个孔中加入20 μl酶标抗体工作液。摇动和混匀后,将反应板在37 ℃下放置15 min。③测值:在完成上述步骤后30 min内使用酶标仪在450 nm处测量吸光度。④做标准曲线:以标准品2 000,1 000,500,250,125,62.5,31.2,0 nmol/ml为横坐标,在纵坐标上绘制OD值,并使用软件绘制标准曲线。⑤根据样本OD值分别计算相应样本的ROS的含量。

血清GSH检测:①根据GSH测试盒说明书测配制标准溶液;②样本前处理:取血清0.05 ml,加试剂一0.2 ml混匀,3 500 r/min,离心10 min,収上清液待测;③加样:根据说明书在空白孔、标准孔、测定孔中加入相应的试剂,混匀,静置5 min,405 nm处,酶标仪测定各孔吸光度值;④测出标准OD值、空白OD值及病人血清OD值,再进一步计算出血清中GSH的含量。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 肝组织病理

肝组织HE染色、Masson三色染色结果显示,正常对照组肝小叶结构正常,肝细胞索排列整齐;模型组可见部分肝小叶结构消失,纤维间隔包绕形成了假小叶,肝细胞可见大量的炎性细胞浸润(见图1)。

2.2 肝纤维形成过程中血清中ROS及GSH水平的变化

随造模时间的延长,肝纤维化的逐渐形成和发展,血清ROS及GSH的水平整体呈增高的趋势,6周时达到最高,8周时有所下降,且模型组大鼠2,4,6,8周血清ROS均较对照组升高,差异具有统计学意义(P<0.05);GSH水平与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05,见表1)。

2.3 正常组及肝硬化组血清ROS及GSH的变化

肝硬化患者血清ROS浓度明显高于正常组,差异有统计学意义(P<0.05),肝硬化患者血清GSH浓度与正常组比较,差异无统计学意义(P>0.05,见表2)。

2.4 相关性分析

将大鼠血清中ROS与GSH结果进行Spearman相关性分析,结果显示ROS与GSH之间存在正相关(r=0.81,P=0.006)。

图1 肝组织HE染色、Masson三色染色 (×40)

表1 两组血清ROS及GSH水平比较

Table 1 Comparison of ROS and GSH in serum between two groups

组别nROS(μg/ml)GSH(μmol/L) 对照组 模型组2周 模型组4周 模型组6周 模型组8周666661.56±0.841.84±0.69∗1.72±0.65∗2.48±1.14∗1.82±0.46∗15.58±8.4218.39±6.8017.17±6.5024.80±11.4018.23±4.58

与对照组相比,*P<0.05

组别nROS(μg/ml)GSH(μmol/L) 正常组 肝硬化组202055.01±40.0990.32±56.74∗0.425±0.1070.577±0.233

与正常组比较,*P<0.05

3 讨论

肝纤维化是一个病理生理过程,是指由各种致病因子所致肝内结缔组织异常增生。任何肝脏损伤在肝脏修复愈合的过程中都有肝纤维化的过程,如果损伤因素长期不能去除,纤维化的过程长期持续就会发展成肝硬化[7],无论其病因如何,肝纤维化通常以氧化组织损伤、炎性细胞浸润、HSC激活和过度胶原沉积为特征[8]。大量的临床经验证实,停止纤维化过程可以逆转肝纤维化。事实上,在去除病因后,可能会出现肝纤维化甚至肝硬化的解决方案[9,10],在一般情况下,修复氧化应激和抗氧化能力之间的平衡,甚至向一个更强的抗氧化能力,能保护肝脏免受进一步的损伤和延缓疾病进展。ROS是参与肝纤维化发病机制的分子事件的介质,这些过程导致细胞损伤,并引发炎症反应,释放多种细胞因子和生长因子,触发静息的肝星状细胞活化及转化为肌成纤维细胞样细胞,进而开始过度合成结缔组织蛋白,特别是胶原,不受控制的广泛纤维化导致肝小叶结构变形,最终导致肝纤维化和肝硬化[11]。本实验结果测的血清ROS的水平整体呈上升趋势,至8周末有所下降,可能是由于随着肝脏功能的损害加重,抗氧化因子如GSH等被大量消耗,机体无法清除产生的大量ROS,导致其明显升高,而在肝纤维化后期,众多促肝纤维化激活因子的活化,使ROS的促纤维化作用弱化,表达水平下降,这一结论表明ROS在肝纤维化的形成过程中发挥着重要的作用。

还原性谷胱甘肽(GSH)是肝脏中合成的硫醇和三肽分子,是参与解毒的亲电试剂和清除自由基,以及抑制ROS的形成,解毒反应性脂质过氧化产物,维持蛋白质巯基状态的主要细胞抗氧化剂[9]。同时由于肝脏对谷胱甘肽周转和器官间谷胱甘肽内稳态起主要作用,因此肝硬化不仅会影响谷胱甘肽的内源性生产和利用,还会导致这种抗氧化营养素的过度消耗,在生理条件下,谷胱甘肽还原酶利用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)作为还原辅因子,将氧化型谷胱甘肽(GSSG)还原回GSH,然而,在严重的氧化应激中,当谷胱甘肽还原酶的能力被抑制或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)被耗尽时,GSSG的积累导致氧化还原防御能力降低[11]。本实验结果肝纤维化过程中血清还原性谷胱甘肽较对照组升高,但升高不明显,可能与GSSG的积累相关,GSH本身随着肝纤维化的加重使其自身被耗竭,故血清中GSH仅轻度升高。

本研究通过体内实验观察了血清中GSH、ROS的动态变化,ROS的可能有促纤维化作用,GSH可能有抗纤维化作用;此外本研究发现GSH及ROS存在正相关关系,说明可能存在GSH通过抑制ROS的产生,修复氧化应激和抗氧化能力之间的平衡,来保护肝脏免受进一步的损伤和延缓纤维化进展,同时肝硬化患者血清GSH、ROS水平与健康正常者相比逐渐升高,这进一步表明肝纤维化的发生和发展可能与GSH、ROS有关。在肝硬化的治疗中,GSH抗氧化能力降低和炎症反应增加,是临床医生应该考虑的问题。由此可见早期使用抗氧化剂GSH可能作为肝纤维化治疗的一个靶点。