四种乳腺癌细胞增殖及迁移能力测定

胡平华 黄 勤 李志华 欧阳倩雯

乳腺癌是一种高度异质性的恶性肿瘤，在全世界女性恶性肿瘤发病率及死亡率居首位[1～3]。乳腺癌的治疗除了考虑肿瘤的组织学分类、大小、临床分期等临床病理参数外，众多的分子标志物如雌激素受体(ER)，孕激素受体(PR)，人类表皮生长因子受体2亚型(HER-2)和Ki-67在乳腺癌临床治疗、预后及化疗过程中起着重要作用[4～6]。目前学者根据ER、PR、HER-2的表达情况将乳腺癌分为Lumial A型(即腔面A型)、Lumial B型(腔面B型)、HER-2阳性型、三阴性型[7,8]。但这四种分型的乳腺癌患者治疗、化疗及预后情况都不尽相同，所以乳腺癌的治疗已逐渐采取精准的个体治疗[4～6]。本研究前期已经采用免疫荧光技术获得这四种分型乳腺癌细胞，本实验将对这四种乳腺癌细胞增殖、迁移能力进行分析，以期能指导临床用药。

1.材料和方法

1.1 主要试剂和仪器 DMEM/F-12(1:1)、B-27、胶原酶Ⅰ、胶原酶Ⅳ购于GIBICO公司，批号分别为1861453，1933114，17100-017，17104-019。Human bFGF购于Bioss公司，批号：AD04041527。Human EGF购于Cyagen公司，批号：L10504123。Human Insulin购于MCE公司，批号：29386。胰蛋白酶-EDTA消化液、链霉素混合液(100X)购于Solarbio公司，批号分别为：T1300，P1400。cck8法细胞增殖检测试剂盒购于凯基生物技术有限公司，批号分别为：KGA317。70微米细胞筛购于NEST。BPN-80CW CO2培养箱购于上海一恒科学仪器有限公司。DHP-9054热恒温培养箱、BYC-310药品冷藏柜均购于山东博科生物。DHG-9070A电热鼓风干燥箱购于恒科学仪器有限公司。CX41显微镜购于OLYMPUS。UV-1600PC紫外分光光度计购于上海美谱达仪器有限公司。

1.2 原代细胞分离及培养 腔面A型、腔面B型、HER-2阳性型、三阴性型(TNBC)乳腺癌细胞由本实验通过免疫组化分离获得。将分类好的4种分型的人乳腺癌样本在超净工作台中分别放入含有双抗(10X)的D-PBS液中浸泡清洗10min。将标本放入培养皿中，以D-PBS液冲洗，用无菌的手术器械剔除多余部分，保留肿瘤组织块备用。将修剪好的乳腺癌标本放在另一培养皿中，浸泡剪碎，过70微米细胞筛收集浸泡液。加入消化液震荡消化，收集滤液并保存。滤液离心去上清，重悬后铺板培养。

1.3 CCK8检测细胞增殖能力 在镜下观察细胞状态良好且细胞的融合度达到70%～80%时，弃去培养液，PBS洗2次，加入胰蛋白酶消化2min，加入完全培养基终止消化，将细胞吹打下来并吸取到10ml离心管中，离心，弃上清，加入培养液重悬沉淀，计数，调整细胞浓度为5×104/ml。向96孔培养板中加入100μL重悬的细胞，置37℃ 5%CO2培养箱培养24h。向每孔中加入10μL的CCK-8溶液(气泡会影响OD值的读数，设法除去孔中生成的气泡)。将96孔培养板放于培养箱内孵育2h。使用酶标仪在450nm波长处检测每孔的光密度。

1.4 划痕实验检测细胞迁移能力 将细胞培养至状态良好后准备划痕迁移。在12孔板底部用直尺划两条平行的直线。胰酶消化后离心细胞弃去上清。用培养基将沉淀重悬后铺于该孔板中，置于培养箱中培养，达到100%的密度后，用枪头在每个孔进行划痕。弃去原培养基，用PBS清洗，加入不含血清的培养基。选取划痕较直的位置拍照，每个孔定点拍0h的照片。将划痕的培养板放入培养箱中培养，24h后再次给每个孔的划痕拍照，拍照位置要和0h的位置(定点)重合，即两次时间点所拍的为同一个位置的划痕。使用24h划痕数据与0h划痕数据求出对应的划痕宽度，进而计算出细胞的迁移速率。计算公式：迁移速率=迁移距离(μm)/迁移时间(h)。

2.实验结果

2.1 细胞活力测定结果 如图1所示，分别为4种分型的人乳腺癌细胞培养24h后的检测结果。CCK8实验结果表明与HER-2型比较，三阴性型乳腺癌细胞活力最高，腔面A型和B型活力较低，差异均具有统计学意义(P<0.01)。

图1 细胞活力的测定注：与HER-2阳性型相比，**P<0.01。

图2-1 划痕实验检测细胞迁移能力

图2-2 划痕实验检测细胞迁移能力注：与HER-2阳性型相比，**P<0.01。

2.2 细胞迁移能力的测定 采用划痕实验检测4种乳腺癌细胞的迁移能力，结果如图2所示：除腔面B型乳腺癌细胞迁移失败，与HER-2阳性型比较，腔面A型和B型迁移速率均较弱，差异具有统计学意义(P<0.01)。三者比较：HER-2阳性型迁移速率最快，腔面A型次之，三阴性型最弱。

3.讨论

自从Perou等学者通过研究乳腺癌表型的多样性提出了乳腺癌的分子分型以来，有众多研究发现乳腺癌不同的分子分型对患者的预后及化疗具有不同的影响[9～11]。目前学者已将乳腺癌分为Lumial A型(即腔面A型：ER/PR+，Her-2且Ki-67<14%)、Lumial B型(腔面B型：ER/PR+，Her-2或Ki-67>14%)、HER-2阳性型(ER-，PR-，HER-2+)、三阴性型(ER-，PR-，HER-2-)[7,8]。研究认为腔面A型乳腺癌患者仅需要进行内分泌治疗，而其他三种分子分型还需要进行化疗[12]。对于HER-2过表达的患者手术前需确认HER-2状态，并辅助靶向药物进行治疗[13]。而三阴性乳腺癌患者预后最差，肿瘤恶性程度高，除了早期诊断外还需要结合化疗治疗[14]。因此经过多年的探索，通过分子分型进行精准的个体化治疗取得了较好的治疗效果。

本研究前期通过原代组织培养及免疫荧光技术分离并鉴定获得了腔面A型、腔面B型、HER-2阳性型及三阴性型乳腺癌细胞。本次研究通过CCK-8法及划痕实验检测四种不同分析乳腺癌细胞的增殖与迁移能力，其中CCK-8实验结果表明三阴性型、HER-2阳性型、腔面A型及腔面B型细胞活力依次降低，而划痕实验结果表明HER-2阳性型迁移速率最快，腔面A型次之，三阴性型最弱。从而说明HER-2阳性患者术后局部复发风险较高，HER-2过表达的乳腺癌患者对三苯氧胺等化疗药物耐药，而且肿瘤恶性程度高，进展速度，转移快，致使化疗效果差[15]；HER-2阳性乳腺癌细胞增殖活力较高，继而使其细胞迁移速率较快，肿瘤恶性生物学行为高，最终导致治疗化疗效果差。

综上所述，三阴性型、HER-2阳性型、腔面A型及腔面B型细胞活力依次降低，且HER-2阳性型乳腺癌细胞迁移速率最快。