清热解毒方对非小细胞肺癌细胞生物学功能的影响

周 婧

近年来，随着人口老龄化和环境污染加剧，肺癌的发病率及致死率逐年增高，已成为癌症引起死亡的主要病种之一[1,2]。在我国，肺癌的发病率和病死率高居所有恶性肿瘤之首，且呈逐年增高的趋势，对人类健康构成严重威胁[3,4]。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)发病率肺癌总发病率的80%～85%，患者生存率较低，5年生存率仅约为15%[5,6]。目前，针对肺癌的治疗方法越来越多，如手术，化疗、放疗及生物靶向治疗等，但是不能有效提高肺癌患者生存率。据报道，复发或转移仍是导致患者预后差、死亡率高的主要原因[7～9]。因此，开发和寻找有效控制肺癌复发或转移的药物对治疗非小细胞肺癌具有重要意义。

由于非小细胞肺癌患者复发率高、转移率高[10]，因此长期服用中药已成为肺癌辅助治疗的重要手段[11～13]。据报道，清热解毒方已应用于中医治疗肺癌、人乳头瘤、子宫内膜癌、鼻咽癌、胃癌等癌症，但并未有研究表明清热解毒方对非小细胞肺癌的影响。本研究探讨清热解毒方对非小细胞肺癌细胞生物学的影响，为临床治疗肺癌提供新思路。

1.材料与方法

1.1 清热解毒方药物组分 银花、连翘、黄连、黄芩购于黑龙江中医药大学附属第一医院门诊部。银花12g，连翘15g，黄连6g，黄芩8g。采取常法煎煮药物，在60℃恒温条件下，将药物浓缩成生药1g/ml的浓缩液，采用压力高温灭菌后，将药物浓缩液保存于-4℃冰箱(Thermo，美国)。

1.2 细胞培养和给药处理 肺癌细胞株A549细胞购于ATCC细胞库，应用含有10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100mg/L链霉素的RPMI 1640培养液(Hyclone，美国)培养细胞，并将细胞置于37℃、5% CO2的培养箱(Thermo，美国)中进行常规培养。待细胞汇合度达到90%以上，应用0.25%胰酶(碧云天，中国)消化细胞，将细胞传至下一代。将细胞分为对照组和清热解毒方不同剂量给药组，给药组分别给予50μl/ml、100μl/ml、150μl/ml、200μl/ml清热解毒方浓缩液后进行后续实验。

1.3 MTT实验 将肺癌细胞株A549细胞接种于96孔板中，待细胞生长至对数生长期时，给予清热解毒方浓缩液，24h后每孔加入20μl的MTT溶液(5mg/ml)孵育细胞，4h后弃净溶液，加入150μl体积的DMSO溶液，震荡混匀。并将细胞置于酶标仪(Biotek，中国)中，在490nm波长处检测细胞吸光度(OD)值。

1.4 台盼蓝染色实验 将肺癌细胞株A549细胞接种于六孔板中，待细胞汇合度达到约80%时，给予清热解毒方浓缩液，24h后收集细胞。向细胞加入0.4%台盼蓝染色液(Biosharp，中国)进行染色。3min内，在倒置光学显微镜(Olympus，日本)下观察细胞颜色，并计数。死细胞被染成淡蓝色，而活细胞拒染。活细胞率(%)=活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100%。

1.5 划痕实验 将肺癌细胞株A549细胞接种于六孔板中，待细胞汇合度达到约80%时，给予清热解毒方浓缩液，并使用经过高压灭菌的200μl吸头(BioClean，中国)在细胞培养板底部进行划痕，并在0h、24h和48h时将细胞置于倒置光学显微镜下，拍照，并观察细胞迁移情况。

1.6 Transwell实验 将肺癌细胞株A549细胞接种于Transwell小室(Corning，美国)上室，上室中已包被基质胶，并加入无血清的RPMI 1640培养基。下室加入含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养液。将小室置于37℃、5% CO2的培养箱(Thermo，美国)中进行常规培养。24h后，取出下室细胞，用4%多聚甲醛(索莱宝，中国)固定30min，PBS清洗细胞后，应用浓度为20g/L的结晶紫染色液(Biosharp，中国)孵育20min，并将细胞置于显微镜下，拍照并计数。

1.7 统计学方法 采用GraphPad Prism 5软件进行统计学分析，组间比较采用两独立样本t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2.结果

2.1 清热解毒方降低肺癌细胞活性 采用MTT实验检测对照组和清热解毒方不同剂量给药(50μl/ml、100μl/ml、150μl/ml、200μl/ml)组肺癌细胞活性。结果显示，与对照组相比，清热解毒方不同剂量给药组肺癌细胞活性显著降低，且肺癌细胞活性随着清热解毒方剂量增加而逐渐降低，100μl/ml和200μl/ml时最为显著(图1)。

图1 清热解毒方对肺癌细胞活性的影响

2.2 清热解毒方降低肺癌细胞活细胞率 采用台盼蓝染色实验检测对照组和清热解毒方不同剂量给药(50μl/ml、100μl/ml、150μl/ml、200μl/ml)组肺癌细胞活细胞率。台盼蓝染色结果表明，与对照组相比，清热解毒方不同剂量给药组肺癌细胞活细胞率显著降低，随着清热解毒方剂量增加，肺癌细胞活细胞率显著降低，呈剂量依赖性。其中，100μl/ml和200μl/ml清热解毒方效果最为显著(图2)。

图2 清热解毒方对肺癌细胞活细胞率的影响

2.3 清热解毒方抑制肺癌细胞迁移能力 采用划痕实验检测对照组和清热解毒方不同剂量给药(50μl/ml、100μl/ml、150μl/ml、200μl/ml)组肺癌细胞迁移。结果显示，与对照组相比，清热解毒方不同剂量给药组肺癌细胞迁移能力显著降低，且肺癌细胞迁移能力随着清热解毒方剂量增加而逐渐降低，100μl/ml和200μl/ml时降低最为显著(图3)。

2.4 清热解毒方抑制肺癌细胞侵袭能力 采用Transwell实验检测对照组和清热解毒方不同剂量给药(50μl/ml、100μl/ml、150μl/ml、200μl/ml)组肺癌细胞侵袭能力。Transwell实验结果表明，清热解毒方不同剂量给药组肺癌细胞侵袭能力显著低于对照组，且100μl/ml和200μl/ml清热解毒方组侵袭能力最低(图4)。

3.讨论

肺癌是呼吸系统常见的恶性肿瘤，是全世界癌症致死的主要病种，每年约有100万人死于肺癌[14]。根据肺癌病理特征，主要肺癌分为小细胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)两种组织学亚型，非小细胞肺癌发病率占80%左右[15]。非小细胞肺癌具有发病率高、复发率高、病死率高、预后差的特点，严重威胁患者的生命和健康。恶性肿瘤的发生、发展是个复杂多变的过程，向其他部位转移是肿瘤致死率高的主要原因[16]。因此，本研究欲寻找能够抑制肺癌细胞迁移和侵袭的药物，为临床治疗肺癌提供理论基础和依据。

图3 清热解毒方对肺癌细胞迁移能力的作用

图4 清热解毒方对肺癌细胞侵袭能力的作用

中医常采用扶正固本法、清热解毒法、活血化瘀法、软坚散结法、祛湿化痰法、以毒攻毒法等方法治疗肿瘤，其中清热解毒法最为常用。中医认为，癌瘤之所成，郁结体内的“癌毒”是其重要原因。采用清热解毒法治疗肿瘤，不但能够抑制肿瘤的发展，而且能够双向调节机体免疫功能，从而达到解毒抗癌的目的。目前，清热解毒方广泛用于多种癌症患者的辅助治疗中，但并未有报道表明清热解毒方是否对肺癌及肺癌细胞有调控功能。因此，本研究探讨清热解毒方对肺癌细胞活力、存活率、迁移和侵袭能力的作用，进而研究其对肺癌发生发展中的影响。MTT实验和台盼蓝染色实验结果表明，不同剂量清热解毒方能够降低肺癌细胞株A549细胞活力和活细胞率；划痕实验和Transwell实验结果揭示，不同剂量清热解毒方能够降低肺癌细胞株A549迁移能力和侵袭能力，100μl/ml和200μl/ml清热解毒方效果尤为显著。

综上所述，我们认为清热解毒方可能通过抑制肺癌细胞活力、迁移和侵袭能力，进而抑制肺癌的发生和发展，但具体机制有待继续研究。治疗肿瘤是一条艰苦又漫长的道路，必须重视其发病原因，针对病因，采用对症的药物和方法，才可有效治疗肿瘤。