SSR 标记在宁波地区水稻品种DNA 指纹图谱构建及纯度鉴定中的应用

王明湖 张孝天 吴国林 蒋琪 施勇烽

（1 宁波市种植业管理总站，浙江 宁波315012；2 江西财经大学艺术学院，南昌330013；3 中国水稻研究所，杭州310006；第一作者：8227155@qq.com）

农作物品种和种子是农业生产最重要的物质基础。随着《种子法》和《植物新品种保护条例》的颁布实施，我国包括水稻在内的农作物种子产业得到迅速发展，种子企业和品种数量明显增加，但同时也存在不同程度的品种雷同、侵权等现象。植物新品种测试（DUS测试）可根据品种特异性、一致性和稳定性试验结果判定品种是否属于新品种，但由于其测试周期较长、工作量大、易受环境因素影响等原因，导致在实践中很难及时高效的对大量品种进行鉴定。

研究表明，分子标记以DNA 序列多样性为基础，能稳定遗传且可反映品种分子特征，具有高度的专一性和特异性，可应用于品种真实性鉴定、纯度鉴定和审定监管等多个环节。我国已在小麦、玉米、水稻等作物品种中建立了DNA 指纹鉴定技术的检测标准，并推荐了一批可用于不同作物的核心分子标记。农业农村部于2007年颁布了《水稻品种鉴定DNA 指纹方法》（NY/T 1433-2007），并于2014年将其修订为《水稻品种鉴定技术规程SSR 标记法》（NY/T 1433-2014），在2007年的行业标准中，推荐的SSR 标记为24 个，在2014年修订版中标记数增加为48 个，这显然可大幅提高品种鉴别能力，更加适应目前水稻品种审定监管的要求。

宁波地处宁绍平原，为浙江省传统的单双季籼粳稻区和水稻高产区[1]。2010—2015年，宁波市农业科学院培育的甬籼15、甬籼69、宁81、宁88 及甬优12 等甬优系列组合在早稻、常规晚粳稻和杂交晚粳稻中的累计种植面积远超其他品种[2]。本研究征集了部分宁波地区水稻品种，利用行业标准推荐引物构建34 个品种的指纹图谱，分析品种间的遗传相似性，同时利用2 个标记对19 个甬优系列杂交稻品种的纯度进行了鉴定，以期为水稻品种鉴定行业标准在宁波地区生产或培育的品种鉴定应用方面提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 供试材料

34 个宁波地区水稻品种用于DNA 指纹图谱数据库构建，主要包括甬优系列杂交稻组合、常规早稻品种、常规晚稻品种及杂交晚籼稻品种，具体为：甬优6号、甬优8 号、甬优9 号、甬优10 号、甬优15、甬优17、甬优12、甬优362、甬优538、甬优720、甬优1512、甬优1540、甬优1640、甬优2640、秀水134、中早39、嘉育253、嘉育280、秀水09、嘉禾218、甬籼15、甬籼69、宁81、黄华占、绍糯9714、台糯1 号、甬糯34、扬两优6号、丰优22、中浙优1 号、秀水519、中浙优8 号、中浙优10 号、宁88。

表1 53 个SSR 标记的基本信息

19 个甬优籼粳杂交品种（甬优9 号、甬优10 号、甬优15、甬优17、甬优12、甬优538、甬优1540、甬优2640、甬优7861、甬优1538、甬优4149、甬优4949、甬优59、甬优58、甬优35、甬优51、甬优31、甬优55、甬优50）用于纯度鉴定。

1.2 DNA 提取

采用简易法提取水稻总DNA，用于数据构建的品种每份提取3 个单株，用于纯度鉴定的品种每份随机提取100 个单株。提取的DNA 溶解于50 μL 的1xTE中，储存于-20℃温度下。

1.3 SSR 标记及PCR

采用农业行业标准NY/T1433-2007 和NY/T1433-2014 推荐的SSR 引物（表1）作为品种鉴定标记，引物由上海生工合成。

PCR 反应总体积10 μL，包含1 μL 的模板DNA、1.5 mmol/L Mg2+、0.2 mmol/L dNTP、正反向引物各0.5 μmol/L、5xSSR buffer 2 μL 和Taq DNA 聚合酶0.5U。扩增条件为94℃预变性2 min；94 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃45 s，30 个循环；最后72℃延伸10 min。PCR 扩增反应在Biometra T-Grandient PCR 仪中进行。

1.4 电泳检测

PCR 扩增产物采用北京六一仪器厂生产的DYCZ-24B 型电泳仪，用6.0%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离和银染显色。电泳缓冲液为1XTBE，电泳电压120V，银染显色后记录带型。

1.5 数据分析

SSR 标记多态性信息含量（PIC）按照公式PICi=1-其中Pij表示标记i 的第j 个等位基因在样本中的分布频率，n 为标记i 总等位基因数，PIC 值用于反应标记在样本中检测的多态性值。同时，应用软件NTSYS，以similarity 方法计算相似系数并进行UPGMA聚类分析。

2 结果与分析

2.1 SSR 标记的多态性

53 对引物在34 份研究材料中共检测到183 个等位基因，平均每对引物获得的等位基因数为3.5 个，每个SSR 标记可以检测到的等位基因数为1～7 个，有49个标记的PIC 在0.3 以上，其中37 个在0.5 以上（表1）。引物RM176 仅检测到1 个等位基因数，引物RM72、RM219、RM297 则检测到7 个等位基因数。根据NY/T-1433-2014 推荐引物的分组，发现I 组平均获得的等位基因数为4.3 个，II 组为3.2 个，III 组为3.3 个，IV 组为2.8 个。将NY/T-1433-2007 中推荐但NY/T-1433-2014 淘汰的5 个标记归为V 组，其平均获得的等位基因数为4.2 个。

表2 利用I 组SSR 标记构建的34 个品种DNA 指纹图谱

2.2 DNA 指纹图谱的建立

以53 个标记建立34 份研究材料的DNA 指纹图谱，表2 为12 个I 组标记获得的34 份材料DNA 指纹图谱。每列数据代表某SSR 标记在34 份材料中检测的带型的数字化代号，如11 表示检测出纯合1 的等位基因型，22 表示检测出纯合2 的等位基因型，而12 则表示检测到包含1 和2 的杂合等位基因型，未检测到任一等位基因型则记为00。这些数字化代号按同样的顺序排列起来就构成了这34 份水稻品种的分子身份证号码，如甬优6 号的I 组分子身份证号码为441512111111124633112211。笔者发现，用I 组标记获得的甬优15 和甬优17 分子身份证号码完全相同，这也表明甬优15 和甬优17 的亲缘关系非常近，仅用12个I 组标记无法鉴定两者的差异，但增加NY/T1433-2014 推荐的另外36 个标记后，则可将甬优15 和甬优17 区分开。

2.3 聚类分析

应用53 对SSR 引物检测34 份供试材料，其遗传相似性系数的变化范围为0.13～0.97，平均相似系数为0.50。基于聚类分析，建立一个系统树（图1），相似系数阈值设为0.50 时，可将上述材料分为2 个类群。类群GI 属于偏粳稻类型，包括14 个甬优系列籼粳杂交稻品种、6 个常规粳稻品种和3 个糯稻品种，类群GII 则属于籼稻类型，其中包括6 个常规籼稻品种和5 个杂交籼稻品种。设相似系数阈值为0.71，又可将类群GI分为GI-I、GI-II 和GI-III 3 个亚群。GI-I 亚群包括甬优6 号、甬优8 号、甬优9 号、甬优1512、甬优12、甬优15、甬优17、甬优538、甬优1640、甬优1540 和甬优2640。GI-II 亚群包括甬优10 号、甬优362 和甬优720。GI-III 亚群则包括常规粳稻嘉禾218、秀水09、秀水134、秀水519、宁81、宁88 和台糯1 号、甬糯34、绍糯9714 等3 个糯稻品种。设相似阈值为0.59，可将类群GII 分为GII-I 和GII-II 亚群。GII-I 亚群包括常规籼稻品种中早39、嘉育253、嘉育280、甬籼15 和甬籼69，而GII-II 则包括常规籼稻黄华占和杂交籼稻扬两优6 号、丰优22、中浙优1 号、中浙优8 号、中浙优10号。

图1 34 个品种的SSR 分子聚类图

图2 引物RM590 检测100 粒甬优50 的结果

2.4 品种纯度分析

引物RM590 在甬优10 号中仅扩增出1 个等位基因，其余18 个品种中均扩增出父母本的2 个等位基因，而RM3331 在甬优9 号、甬优1540、甬优2640 等9 个品种中扩增出父母本的2 个等位基因。利用引物RM590 和RM3331 分别对19 个甬优系列杂交稻组合进行纯度分析。结果表明，100 粒随机抽取的样品中，甬优50 和甬优2640 在2 个标记中均检测到1 个相同单株的混杂，图2 为甬优50 的100 个随机单株用RM590 标记检测的电泳结果。其余17 个品种均未检测到混杂单株。

3 讨论

目前SSR 标记已广泛应用于水稻品种数据库构建。程本义等[3]对2002—2006年浙江省98 个主要的水稻品种及2007—2008年155 个浙江省区试品种进行了DNA 指纹检测，应用12 个SSR 标记构建了279 个次水稻品种DNA 指纹图谱数据库。马红勃等[4]用2007 版行业标准推荐的24 个SSR 标记分析了福建省24 份杂交稻品种和18份杂交稻亲本的遗传多样性，并建立了42 份材料×12个标记的指纹图谱。另外，有研究者也利用SSR 标记分析了品种的遗传多样性，如罗兵等[5]应用24 个SSR 标记对太湖稻区现代粳稻品种的遗传背景进行分析，发现该区域种植的粳稻品种背景相似性高，多样性不够丰富。

本研究利用SSR 标记对34 份宁波地区水稻品种进行了遗传多样性分析，53 个SSR 标记共检测到183个等位基因，每个标记可检测出的等位基因的范围是1～7 个，平均每个SSR 标记获得3.5 个等位基因，明显低于云南陆稻品种的平均等位基因数（8.125）[6]，也低于太湖地区粳稻品种的平均等位基因数（4.57）[5]，稍高于广西和广东优质常规稻的平均等位基因数及黑龙江主栽品种的平均等位基因数[7-8]，这可能与选用的SSR标记及实验材料的差异有关。

左示敏等[9]利用行业标准NY/T-1433-2007 和NY/T-1433-2014 中分别推荐的24 个和48 个标记均不能完全将46 份江苏粳稻相互鉴别开，这既表明江苏粳稻品种间的遗传基础较为狭窄，也说明现有标准并不能完全适用于江苏粳稻特异性鉴定。林亦霞等[10]在利用标准推荐引物建立94 份杂交稻亲本的数字分子指纹库时，发现RM176 和RM551 的多态性不高。本研究同样发现，RM176 等部分推荐标记的多态性不高，对测试品种的鉴别力较弱，在后续的应用中需要进一步筛选一些多态性高的SSR 标记，以提高SSR 标记对水稻品种的鉴别力。