急性肾损伤相关性SIRT研究的动物实验模型分析*

贾圣琪, 裴汉军

(1.内蒙古科技大学包头医学院2016级硕士研究生，内蒙古 包头 014060;2.内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院心内科)

AKI是一组常见的临床综合证，一般指突发(1～7 d内)和持续(>24 h)的肾功能突然下降[1-2]。研究发现，AKI可造成肾小管上皮细胞线粒体稳态失衡，从而导致细胞信号转导紊乱。同时，在体和离体动物实验表明，AKI可导致肾小管上皮细胞线粒体内膜的呼吸链相关酶活性异常，以及线粒体通透性改变[3]。另一方面，AKI可引起线粒体分裂蛋白Drp1大量激活，导致线粒体分裂、片断化、肾小管上皮细胞凋亡[4-5]。

SIRT是依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸辅酶的具有去乙酰化活性的一大类进化保守蛋白家族，可调控细胞应激、代谢、衰老和凋亡等过程，共有7种亚型(SIRT1～7)[6-7]。近期研究显示，多种原因导致的肾脏损伤会导致线粒体SIRT水平下降，其水平变化与肾功能损伤加重，细胞信号转导障碍，能量代谢异常，线粒体的裂解融合失衡，以及细胞凋亡水平升高明显相关。这些研究提示SIRT将成为线粒体靶向治疗AKI的新思路[8-12]。

目前，SIRT的研究趋于火热，而各种研究对于动物实验模型的选择又有所不同，选择正确的动物模型对于SIRT蛋白功能的研究至关重要。本文以上研究的动物实验模型做出如下综述。

1 AKI相关性线粒体SIRT研究的模型动物选择

如今，可用于AKI模型建立的试验动物多种多样，但实际选择中，动物经济成本、试验周期的控制，以及造模效果等因素都是制约试验动物选择的关键因素[13]。

非人灵长类动物十分稀缺，数量有限，模型建立后的数据难以构成统计学意义，且成本高昂，造模要求高，故目前鲜有选择；猫、狗在生理学特性以及对药物和毒物反应上与人类有相似之处，但其选择往往受到动物保护主义及伦理问题限制，同时造模条件严格，经济成本高，故依然选择较少；小型猪、兔、大鼠在造模选择中虽然较少受到动物保护及伦理的影响，但其对肾脏损伤耐受较强，故试验中会导致造模周期延长，同时实验个体的生长周期久，难以在较短时间大量繁殖培育，故大量选择会较高提升实验成本，因此以上三者的选择同样存在较多顾虑。

在众多实验动物中，小鼠是目前世界上品种、品系最多，使用量最大且研究最为详尽、用途最广的实验动物，其在遗传、肿瘤、免疫等多个学科领域中均有广泛应用。同时，在生理特点方面具有较多优势。首先，小鼠生长快、生长周期短、成熟早，有利于繁殖生产；其次，个体体型较小，便于试验操作，模型建立要求较低；再有，小鼠的生理数据使用较为普遍，已有大量研究支持，受到长期讨论证实；最后，小鼠对外界刺激耐受较差，对试验干预更为敏感，造模效果较其他动物有明显优势。综合考虑，小鼠饲养管理方便，容易达到标准化，造模成本低、效果好，在急性肾损伤相关性线粒体SIRT改变的研究中脱颖而出，经过多重因素的筛选，小鼠成为目前较受欢迎的试验动物[14-15]。

然而，小鼠品种、品系繁多，各自的生理特点有所不同，选择合适的品种、品系是试验模型建立的关键问题。近些年来，急性肾损伤相关性线粒体SIRT改变的研究中，C57BL/6小鼠被广泛使用。该小鼠被认作“标准”的近交系，并且已经完成其基因序列的测定，在遗传学、肿瘤学、生理学、免疫学研究中均为常用品系。在该研究的试验模型中，其生物学特征有以下优势：第一，乳腺肿瘤的自然发生率低，致癌剂使用难以诱发肿瘤，故试验干预造成小鼠癌变可能较小，病理标本，实验数据较为稳定；第二，对放射线耐受力中等，造模中如涉及放射干预，动物反应更为敏感；第三，补体活性高，较易诱发免疫耐受性，试验操作受到动物免疫因素干扰较小；第四，因常被认作"标准"的近交系，故为许多突变基因提供遗传背景，同时在试验模型的建立中，为培育SIRT基因剔除小鼠提供了试验基础，使试验模型的分组对比上升到了基因转录、蛋白表达层面，严谨性、科学性进一步得到提升。综上可知，C57BL/6小鼠的选择对此研究更具说服力[16-18]。

2 小鼠AKI模型的建立

AKI相关性线粒体SIRT研究的基础是在试验动物水平建立起AKI模型，该模型的可行性、科学性缺一不可，同时又需要对研究方向做出针对性的调整。目前AKI的造模方式多种多样，针对SIRT的研究却很有限，因此选择合适AKI模型就显得至关重要。以下列举近些年相关研究的常用AKI模型思路，以便进一步分析思考。

2.1模型一 双侧夹闭小鼠肾脏缺血再灌注损伤模型[19-20]选用C57BL/6雄性小鼠，6～8周龄，体重20～25 g，用随机数表法分为对照组(Control Group,C组)，假手术组(sham operated group,S组)、缺血再灌注组(Ischemia reperfusion injury Group,IR组)，其中C组4只、S组32只、IR组32只。C组：不予手术处理。S组：用10 %的水合氯醛(3 ml/kg)通过腹腔注射的方式麻醉小鼠，随后取腹部正中切口切开腹壁，暴露、游离双侧肾蒂，不进行肾蒂夹闭操作，其余同IR组。IR组：用10 %的水合氯醛(3 ml/kg)通过腹腔注射的方式麻醉小鼠，随后取腹部正中切口切开腹壁，暴露、游离双侧肾蒂，进而用无损伤止血夹夹闭小鼠双侧肾蒂，肾脏由红色变为紫色即证明已造成肾脏缺血，夹闭成功，进一步夹闭持续30 min；夹闭时间结束后，打开微动脉止血夹恢复肾脏供血，若肾脏颜色变化为由紫黑色逐渐恢复红色，证明再灌注成功；再灌注完成后，逐层缝合腹部创口。操作全程注意无菌原则，同时术中如有重要器官或大血管损伤，应及时剔除。待S组、IR组小鼠术后清醒后，将其放回笼中，密切关注其生命体征。S组和IR组小鼠分别于再灌注0 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h，5 d、7 d处死采样(4只/时间点)。

2.2模型二 单侧夹闭、对侧肾切除小鼠肾脏缺血再灌注损伤模型[21-22]选用24只C57BL/6小鼠，雄性，体重25～28 g，随机将小鼠分为三个组(8只/组)：S组、IR组、干预处理+IR组。每只小鼠均通过吸入异氟烷的方式麻醉。IR组：腹部皮肤中央区域碘伏消毒，腹部正中切口剖腹，游离双侧肾蒂，左侧肾门部结扎肾动脉和输尿管，切除左侧肾脏，留取肾脏组织标本；右侧肾蒂用无损伤微动脉止血夹夹闭(肾脏颜色由樱桃红转为深紫色即为夹闭成功)，持续夹闭30 min，夹闭时间结束后，松开止血夹恢复肾脏灌注(肾脏由深紫色恢复樱桃红色)；操作结束后，缝合腹部创口，将术后小鼠放置于保温加热板上，直至小鼠清醒。S组：同样进行麻醉、消毒、腹部切开操作，术后保温自然苏醒，但不进行左侧肾切除，右侧肾蒂夹闭操作。干预处理+IR组：于术前或术后对小鼠进行药物干预操作，其余处理同IR组。各组小鼠均于肾脏再灌注后24 h处死取材(经眼球静脉丛取血，开腹取肾脏组织)，进一步送检分析。

2.3模型三 甘油注射小鼠急性肾损伤模型[23]选用18只C57BL/6清洁级小鼠，雄性，6～8 周龄，体重18～22 g，随机分为3组(6只/组)：C组，AKI组，干预处理+AKI组。各组小鼠均在操作前禁水12 h。C组：在小鼠双侧股肌内侧注射生理盐水(8 ml/kg)。AKI组：将用PBS稀释后的50 %甘油，于小鼠双侧股肌内侧注射，剂量为8 ml/kg。干预处理+AKI组：甘油注射同AKI组，造模6 h后，进行干预处理，于小鼠尾静脉注射药物或生物制剂200 μL。实验阶段全程对小鼠进行分笼清洁级动物喂养，室温保持在20℃左右，相对湿度为40 %～60 %。操作结束3 d后，处死全部小鼠，并取血及双侧肾脏进行进一步检验分析。

2.4模型四 结扎盲肠小鼠急性肾损伤模型[24]选用30只C57BL/6小鼠，雄性，6～8 周龄，体重20～25 g。用随机数字法将小鼠分为3个组(10只/组)：脓毒症组(cecum ligation and puncture,CLP组)、脓毒症+干预组、S组。首先对小鼠进行麻醉，采用2 %戊巴比妥钠(80mg/kg)，腹腔内注射,待小鼠麻醉至合适的麻醉深度后，取仰卧位固定于动物实验手术台，进一步备皮消毒腹正中部手术区域，随后进行各组操作。CLP组：于小鼠腹正中线剖腹切开，切口约1.5 cm，用镊子游离小鼠的盲肠和肠系膜，进而于回盲部一下位置用无菌丝线(4号)环形结扎盲肠，然后用针头(20号)于盲肠末端部位进行穿刺，尝试可以挤出粪便即可，接着将盲肠及腹腔内组织还纳腹腔，逐层进行缝合关腹；术后将1 ml生理盐水注入小鼠背部皮下，行体液复苏，术后自由进食水。脓毒症+干预组：盲肠结扎及穿刺等造模步骤同CLP组，于造模1 h后，对小鼠进行腹腔内注射，行药物或生物制剂干预处理。S组：余操作同脓毒症+干预组，但不进行盲肠结扎和穿孔，操作后腹腔内注射药物替换为等量生理盐水。三组小鼠均于操作完成后24 h进行适量麻醉(方法同前)，随后处死取材：经一侧眼球取全血，量约7 00～1 000 μL，随后进一步送检；沿小鼠腹正中线切开腹腔，分离暴露主动脉以及双侧肾蒂，采取肾切除术，取双侧肾组织进一步检验。

2.5模型五 顺铂诱导小鼠急性肾损伤模型[25]选用18只C57BL/6清洁级小鼠，雄性，周龄8周左右，体重22～25 g。随机将小鼠分为3组，每组各6只：顺铂10 mg/kg组，顺铂20 mg/kg组，C组。操作前，将顺铂以1 g/L溶于生理盐水中。顺铂10 mg/kg组：将顺铂以10 mg/kg的剂量对小鼠进行腹腔注射。顺铂20 mg/kg组：将顺铂以20 mg/kg的剂量对小鼠进行腹腔注射。C组：将生理盐水替代顺铂进行注射，剂量为每10g体重单次腹腔注射0.9 %生理盐水0.2 mL。三组小鼠均于注射药物72 h后处死，留取血液、尿液标本，同时切开腹腔游离肾脏，留取肾组织标本，进一步送检。

3 小鼠AKI模型的分析与选择

以上5种模型为近些年来AKI相关研究的常用模型，每组模型都有各自的优势与不足。其中双侧夹闭缺血再灌注模型省去了单侧肾切除术，降低了术中意外损伤、出血的风险，术后小鼠恢复好，存活率高，相对于其他侵入性操作模型更为简单且成功率高，从而降低了模型成本，但是该模型小鼠的代偿能力较强，术后肾功能恢复较快，肾功能损伤相关生化指标变化趋势欠明显；单侧夹闭、对侧肾切除小鼠肾脏缺血再灌注损伤模型，降低了小鼠的肾功能代偿能力，术后肾功能损伤较明显，相关生化指标损伤趋势明显，但对实验者操作要求更高，小鼠容易在造模过程中意外死亡，术后存活率较低，故在一定程度上降低了造模成功率，增加了试验成本；甘油注射小鼠急性肾损伤模型，利用了甘油注射后横纹肌溶解进而导致AKI的原理，操作简单，小鼠对操作反应较小，且避免了麻醉死亡的风险，但该操作对药物准备要求相对较高，须保证药物浓度调配无误，剂量精确，同时应熟练掌握操作中的注射方法，如研究内容受甘油注射干扰需选择其他模型；结扎盲肠小鼠急性肾损伤模型，针对脓毒症造成的AKI研究有针对性意义，由于解剖结构原因，造模中导致严重损伤的可能性较小，术后恢复较好，但该模型的对操作者解剖基础要求较高，操作相对繁琐，且术后由于小鼠个体差异，以及对感染的耐受不同，模型效果相对不稳定，如研究内容受感染因素干扰，应考虑选择其他模型方法；顺铂诱导小鼠急性肾损伤模型，操作简单，操作后AKI效果明显，避免了麻醉，侵入性操作的风险，但该模型的药物成本更高，同时要求操作者对化疗药物的特点及计量调整熟练掌握，如化疗药物的使用对研究内容存在干扰应考虑其他模型方法。

4 AKI相关性线粒体SIRT研究中动物模型的思考与展望

SIRT作为一种对于细胞应激、代谢、衰老和凋亡等过程具有保护及调节作用的蛋白，以每种模型作为基础进行研究均有其价值所在。造影剂肾病(Contrast-induced acute kidney injury, CI-AKI)、糖尿病肾病、横纹肌溶解症相关性急性肾损伤、脓毒症急性肾损伤以及顺铂急性肾损伤均是临床中棘手的难题，以上模型可在一定程度上模拟相关临床疾病的发病机制，进而在此模型基础上的SIRT的研究将进一步明确SIRT在各类疾病中的影响与相关机制，对各类疾病导致的AKI提供线粒体靶向治疗的可能性。

近些年来，随着冠心病患者从冠脉介入中的临床获益程度日益增加，介入治疗的相关并发症也逐渐凸显，其中CI-AKI是临床中较为常见的问题。CI-AKI的基本病理生理过程是急性肾小管上皮细胞缺血，以缺血再灌注损伤为基础的小鼠的AKI模型可较好的模拟CI-AKI，这使得与CI-AKI密切相关的“肾脏缺血对线粒体特异性SIRT 的影响及机制研究”更为可行。该研究具有深刻的现实意义，对今后临床中CI-AKI的防治思路提供了新的契机，值得我们在今后的学习中进一步关注。