上皮间质转化的相关生物标志物在大肠癌中的研究进展*

孙红梅，武金宝

(1.内蒙古科技大学包头医学院2016级硕士研究生，内蒙古 包头 014060；2.内蒙古科技大学包头医学院第二附属医院内蒙古消化病研究所)

大肠癌(Colorectal cancer，CRC)是世界上常见的恶性肿瘤，分为结肠癌和直肠癌，是多基因、多因素、多步骤的复杂的过程，是当下严重影响人类健康的恶性肿瘤之一。癌症统计结果显示，在恶性肿瘤发病率中结直肠癌居第3位，死亡率居第4位[1]。大肠癌的5年生存率仍然不是很高，50 %以下[2]。纵然近些年大肠癌的早期诊断方法有了提高和进步，可是因为大肠癌早期临床症状如排便习惯的改变与粪便性状的改变相对比较隐匿，得不到患者的充分重视，容易受到患者忽视，如若出现肠梗阻等明显症状时，才会引起患者的注意，这时来医院就诊一般是结肠癌中晚期，这也是其死亡率居高不下的缘由之一。大肠癌的治疗主要以手术治疗为主，联合放化疗，以及最近新兴的靶向治疗、基因治疗及免疫治疗等。但是，术后的复发及转移仍然不能得到满意的控制，仍是大肠癌患者死亡的主要原因。因此，寻找有效的治疗方法是刻不容缓的，靶向治疗是目前研究的热点，想要寻找有效的靶向药物，就必须要对大肠癌发生发展、浸润及转移机制进行深入的透彻的研究，并且还可以对具有共同机械特性的其他癌症的诊治提供参考。近年来的学术研究中发现上皮间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transitions,EMT)在大肠癌的发生发展、侵袭和转移中起到举足轻重的作用。我们是否可以通过对EMT的深入研究，寻找到有效的治疗方法。

1982 年，Greenburg 和Hay首次提出了上皮间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transitions,EMT)概念，他们在研究晶体状上皮细胞时发现，这种上皮细胞可以在胶原凝胶培养基中形成拥有伪足的间质细胞[3]。EMT在生理过程和病理性反应中均表现出重要作用[4]。EMT是指在特定的情况下，上皮细胞向间充质细胞转化的现象，此转化过程会导致细胞的极性丧失，丢失细胞间的紧密连接和粘附连接，与周围细胞和基质的接触减少，从而获得更强的细胞迁移、侵袭、增殖及抗凋亡能力[5]，同时，细胞表型发生改变，上皮表型，如：E-钙粘蛋白(E-cadherin)、α-连环蛋白(α-catenin)、β-连环蛋白(β-catenin)、细胞角蛋白、粘蛋白、桥粒蛋白等逐渐丧失，而获得间质表型，如波形蛋白(vimentin)、纤连蛋白、神经型钙粘蛋白、基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-3、MMP-9等的表达增加[6]。故就近几年来关于EMT相关的生物标志物,如E-钙粘蛋白(E-cadherin)、β-连环蛋白(β-catenin)、波形蛋白(vimentin)、转化生长因子β1(Transfrming Growth Factor β1)、P21活化激酶(p21-activated kinases 1，PAK1)等在大肠癌中的最新研究进展作一综述。

1 E-cadherin

1.1E-cadherin 的结构 E-cadherin基因位于16号染色体q22.1 ,是一个至关重要的抑癌基因,在1995 年由 Berx 首先克隆[7]。人源性 E-cadherin 由CDH1 基因编码，是迄今研究最多的钙黏蛋白家族成员。E-cadherin的分子量为124KD ，约由720 -750左右的氨基酸构成的，一类广泛地存在于各种上皮源组织中的依托于钙离子的跨膜糖蛋白，包括N 端的胞外区、C 端的胞内区及高度疏水的跨膜区。胞外区是钙离子的结合位点，E-cadherin分子之间通过胞外区结构域相互形成链接;胞内区能与 β-连环蛋白(β-catenin)、α-连环蛋白(α-catenin)结合形成复合体，后者直接与细胞骨架肌动蛋白连接，用以维持上皮细胞的极性和细胞间粘附的稳定性[8]。E-cadherin介导的细胞粘附系统的失调涉及到许多癌症的上皮-间质转化和肿瘤进展，包括结直肠癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌等等[9-11]。

1.2E-cadherin 与大肠癌 研究表明，在大肠癌恶性进展中，E-cadherin会出现表达下调或完全丢失，进而导致肿瘤细胞之间粘附力下降，这会使肿瘤细胞侵袭及转移的能力增加，因此肿瘤的恶性程度增高，预后变差[12]。E-cadherin 表达下调被认为是EMT 的标志性事件[13]。E-cadherin 表达的降低可由基因突变、启动子甲基化、染色质重构、下游转录因子的修饰以及转录抑制引起[14-16]。Palaghia等[17]收集CRC结肠切除术的65例患者，采用免疫组化的方法进行比较原发性CRC和淋巴结转移中的E-钙粘蛋白表达与正常结肠粘膜和正常淋巴结表现的表达的差异，结果显示，与正常结肠粘膜相比，原发性CRC表现出较高的异常E-钙粘蛋白表达率(P<0.001)，同时发现E-cadherin在良好和中分化的CRC中比低分化中呈现出显著的高表达，这也就进一步说明了E-钙粘蛋白是肿瘤侵袭性和扩散潜力的重要标志。同样，在我国的研究学者如顾国利等研究[18]主要是应用免疫组化的方法检测60例大肠癌肿瘤组织标本和8例正常组织标本发现E-cadherin 在大肠癌组的阳性表达率显著低于正常组，并发现E-cadherin阳性表达率与侵犯深度及淋巴结转移密切相关，这说明了E-cadherin的表达异常不仅与大肠癌的浸润和转移相关，同时与大肠癌的早期发生相关。隋立荣等[19]通过应用组织芯片，采用免疫组化法的检测方法，检测结果提示大肠癌组织内 E - cadherin的表达与正常黏膜上皮有显著差异，同时发现淋巴结转移越多,E -cadherin的表达越差；TNM分期越高，E -cadherin的表达越差；并且发现与癌组织的分化程度有显著差异，E - cadherin的表达随着肿瘤分化程度的降低而下降。以上实验结果均能说明E-cadherin的异常表达不仅与CRC的发生有关，还与肿瘤的侵袭及转移密切相关。

2 β-catenin

2.1β-catenin的结构 β-catenin 基因定位于染色体3p21.3，全长23.2 kb，共有16 个外显子，其 m RNA长度为3362 个核苷酸残基。β-catenin 基因编码产物为β-catenin 蛋白，是 Wnt 经典信号传导通路的关键因子，在大肠癌的发生发展和转移过程中发挥着非常重要的作用[20,21]。β-catenin具有双重调节功能并且能够独立发挥调节作用。β-catenin主要有两个功能，其中一个作用就是它作为一种重要的细胞粘附分子和细胞骨架成分，β-catenin与E-cadherin结合成E-cadherin/β-catenin复合体，该复合体均匀分布于细胞膜上，参与同种细胞间粘附的调节[22]。另一作用就是参与Wnt 经典信号传导[23]。细胞浆内的β-catenin与APC、GSK-3β及Axin 蛋白结合形成多蛋白复合体,通过GSK-3β磷酸化与去磷酸化的过程来降解β-catenin，因而致细胞浆内游离的β-catenin的水平极低, 不能够移位至细胞核去调控相应靶基因表达，但是当Wnt信号转导通路开启时，胞浆内游离的β-catenin积累增多, 游离的β-catenin与 Tcf-4结合形成复合物, 启动负责细胞周期调节和细胞增殖的基因异常表达, 从而促进肿瘤细胞的生长[24～26]。 上皮间质转化涉及几种重要的信号转导通路，但是Wnt 经典信号传导通路是EMT过程中的主要通路之一。Wnt 经典信号传导通路主要包括：细胞外因子(Wnt)、跨膜受体Frizzled(Frz)、β-catenin 蛋白(β-catenin)及T细胞趋化因子(TCF)等一系列蛋白。有研究表明，E-cadherin/β-catenin复合体在建立细胞极性、细胞间黏附的稳定性、维持组织形态等方面拥有至关重要的地位，然而，当出现某些因素造成E-cadherin/β-catenin复合体减少后缺如后，会导致细胞间粘附力降低，进而使肿瘤细胞更容易脱离原发灶，固然就易于造成侵袭以及转移[27,28]。

2.2β-catenin与大肠癌 戈锐等[29]实验结果发现，在大肠癌组中β-catenin膜表达缺失、β-catenin异位表达、Cox-2和MMP-7阳性表达较正常大肠黏膜组显著增高(P<0.05)，并同时发现大肠癌中 β-catenin的异位表达只与大肠癌的Dukes分期呈正相关关系。β-catenin与大肠癌的发生发展密切相关。许多作者报道Wnt /β-catenin信号在CRC的发生和发展中起重要作用;然而，由于Wnt信号通路的复杂性，尚不清楚哪种Wnt配体亚型影响CRC的进展[30,31]。Yoshida N等[32]分析了201例接受CRC治愈性手术的患者，采用免疫组化的方法检测Wnt和β-catenin蛋白的表达，结果显示出，在多变量分析中，淋巴结转移(P=0.046)和核β-连环蛋白的高表达(P=0.04)是存活的独立预后因素，并且实验结果提示Wnt1可能是β-catenin信号传导途径的主要激活剂，并且Wnt5a可稳定粘附连接，从而抑制上皮- 间质转化。Emons G等[33]通过进行体外实验，发现Wnt /β-连环蛋白信号的异常激活不仅调节结直肠癌的发展和进展，而且还介导直肠癌对化学放射疗法的抗性。

3 Vimentin

3.1Vimentin的结构 人波形蛋白(Vimentin)由位于染色体10p13上的单拷贝基因编码的细胞骨架结构蛋白[34]。Vimentin存在于间充质细胞的细胞质中，其功能是维持细胞结构和组织完整性。研究显示，vimentin作为恶性肿瘤和EMT的标志物，在间质来源细胞显示阳性，在上皮来源肿瘤细胞则显示阴性[35]。因此，上皮细胞出现vimentin表达提示恶性肿瘤发生上皮间质化[36]。Vimentin过度表达见于乳腺癌[37]、肺癌[38]、胰腺癌[39]、胃癌[40]、结直肠癌[41]、宫颈癌[42]，透明细胞肾细胞癌[43]等等。

3.2Vimentin与大肠癌 国外的研究学者[41]进行体外实验研究发现，波形蛋白阳性的SW480结肠癌和MDA-MB-231乳腺癌细胞的体外侵袭性最高，并且通过RNA干扰降低波形蛋白的表达后抑制了结肠癌和乳腺癌细胞系的迁移和侵袭。刘海丽[44]对91 例大肠癌组织(实验组)和32 例癌旁组织(对照组)应用免疫组化方法对E-cadherin 及Vimentin进行检测发现，可以看出，Vimentin的表达与 E-cadherin 表达相反。在结直肠癌中，波形蛋白基因甲基化最近引起了很多关注，并且有望在晚期结直肠癌中频繁发生[45]。可以利用这种现象来开发高灵敏度技术来检测包括血清和粪便在内的临床样品中波形蛋白基因的甲基化[46-48]。

4 TGF-β1

4.1TGF-β1的结构 转化生长因子β1(Transfrming Growth Factor β1) 是一种由多种细胞分泌的多肽类细胞因子，并且具有多种生物学效应。目前对TGF-β1的研究最为广泛[49]。 TGF-β1引起的EMT是通过与其特异性受体TGF-βR结合后启动下游的SMAD分子来完成的[50]。TGF-β1还可以通过非SMAD分子信号途径激活NF-κB、STAT3，将细胞膜表面信号转导至细胞核。TGF-β1增高后可磷酸化β-catenin酪氨酸残基,导致E-cadherin/β-catenin(E-钙粘蛋白/β-钙粘素相关蛋白)复合体分离,游离的β-catenin在细胞浆内积累增加，进而转移至细胞核内，激活转录因子，诱导靶基因表达,激活Wnt信号通路。

4.2TGF-β1与大肠癌 刘宇[51]应用TGF-β1进行处理SW620细胞，通过Western Blot方法检测Vimentin、Ecadherin蛋白的表达发现：上皮标志物E-cadherin 蛋白发生表达下降、间质标志物 Vimentin 蛋白发生表达升高，说明SW620 细胞 EMT的发生。充分证明了TGF-β1可以诱导大肠癌细胞发生EMT。Langenskiöld M等[52]纳入了169例接受结肠直肠癌手术的患者,进行检测大肠癌组织、距离大肠癌组织10cm的无肿瘤肠组织(正常肠粘膜)以及患者血浆中TGF-b1活性和总TGF-b1的浓度，实验结果显示，与宏观无肿瘤组织相比，肿瘤组织中总TGF-b1蛋白表达显着升高(P<0.0001)，肿瘤中TGF-b1蛋白的表达随着T期的增加而增加(P=0.0006)，并且发现转移性疾病患者与没有转移性疾病的患者相比，肿瘤组织(P=0.004)和血浆(P=0.001)中TGF-b1蛋白表达均升高。另一个有趣的实验，熊斌等[53]应用免疫组织化学的方法检测98例大肠癌组织中TGF-β1、VEGF的表达和MVD的值，结果发现TGF-β1的表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移、临床病理分期有关，与VEGF的表达、MVD呈明显正相关。这说明TGF-β1与大肠癌血管生成有密切关系，可能直接促进血管的生成或通过VEGF间接促进血管的生成，但具体机制尚不明确。

5 PAK1

5.1PAK1的结构 PAK1是丝氨酸/苏氨酸蛋白质磷酸化激酶家族的成员[54]，即p21小GTP酶活化激酶1，是小G蛋白Rho家族的下游靶蛋白。根据它们结构特性及调节机制的不同,可分成：Ⅰ类(PAK1、PAK2、PAK3)，Ⅱ类(PAK4、PAK5、PAK6)[55]。Ⅰ类与Rho家族GTPase成员如Cdc42/Rac1等结合后被活化而具有激酶活性，而Ⅱ类虽然能与之结合但不能被活化[56]。PAK1是PAK家族中第一个被鉴定出来且研究最多的分子。PAK1与细胞的分裂、凋亡、人类的多种恶性肿瘤密切相关，例如：乳腺癌、肺癌、淋巴瘤和黑色素瘤等[57-60]。己知PAKs表达均受生长因子的上调,特别是PAK1的表达受转化生长因子TGF-β的上调。由于TGF-β调节上皮一间充质(EMT)的转换,而PAK1调节上皮细胞的粘附,延展和细胞迁移性并被TGF-β调节,提示PAK1在调节EMT的过程中起重要作用。

5.2PAK1与大肠癌 武金宝[61]进行的实验提示PAK1在大肠癌发生、发展和转移中起重要作用。Carter JH等[62]通过免疫组织化学检测来自38名患者的184个总标本包含了正常人结肠组织，腺瘤，浸润性癌(I-III / IV期)和淋巴结转移，实验提示与正常结肠相比，在腺瘤，侵袭性癌和淋巴结转移中PAK-1表达显着增加(P<0.0001)，并且还发现Pak-1在淋巴结转移中的表达显着高于浸润性癌，腺瘤或正常结肠(P<0.0001)。Gui Z等[63]进行的体外激酶实验结果表明PAK1能够特异地直接磷酸化β-catenin S675 位点来参与信号传递，也就是说，PAK1参与Wnt/β-catenin 信号转导。

6 小结与展望

EMT被认为是肿瘤侵袭和转移各种恶性肿瘤的关键过程，如乳腺癌[64]、结肠直肠癌[65]、前列腺癌[66]和肺癌[67。此外，EMT与细胞凋亡、放射抗性、化疗耐药性、干性和预后不良有关[68,69]。虽然目前取得众多进展，但是还是有一些问题处于起始阶段，例如EMT的相关信号通路及分子机制尚处于探索阶段，相关的研究结果将会为临床上治疗肿瘤提供重要的靶点，为新的靶向药物的研究提供新思路。虽然，目前对EMT的相关研究还不是很深入，但随着时间的发展及广大学者对此的重视，相关的研究必将不断深入，人类对EMT的相关机制的了解也会越来越明白，为大肠癌的新药提出重要的指导意见。