超高效液相色谱法同时检测丹参中14种水溶性成分*

李垚，杨德智，苏斌，杜冠华，吕扬

(1.北京协和医学院中国医学科学院药物研究所晶型药物研究北京市重点实验室，北京 100050；2.山东济世药业有限公司，莱芜 271100；3.北京协和医学院中国医学科学院药物研究所药物靶点研究和新药筛选北京市重点实验室，北京 100050)

丹参是唇形科植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bre.)的干燥根及根茎[1]，是我国一种传统中药材，应用历史悠久，用途广泛。据《神农本草经》记载，丹参主治“心腹邪气”，能够“破症除瘕，止烦满，益气”[2]，《本草纲目》记载丹参还具有“活血，通心包络，治疝痛”[3]等功效。20世纪30年代以来，通过对丹参成分组成的研究发现丹参中100多种物质，并且经过进一步药理实验挖掘出丹参水溶性成分抗氧化、抗菌和治疗心脑血管疾病的作用[4-7]，考察山东省莱芜市丹参药材的直径和丹参植株的部位对其水溶性成分含量和分布的影响，能够为道地产区的丹参药材的筛选，丹参茎叶资源的利用最大化提供参考。丹酚酸类成分结构单元多为丹参素与咖啡酸，结构相似，难以分离[8]，故可以同时测定14种水溶性成分的方法鲜见报道，目前测定丹参水溶性成分一般采用高效液相色谱(HPLC)法，当分离的水溶性成分较多时，每个样品运行时间会达到60～70 min[9-13]，这不仅不能用于大量样品的检测，还会造成更多资源的浪费。笔者采用超高效液相色谱(UPLC)法，建立同时测定丹参中14种水溶性成分的检测方法，大大缩短检测时间，节约资源，为丹参中多种水溶性成分的快速检测提供参考。

1 仪器与试药

1.1仪器 Acquity H-classUPLC(美国Waters公司)包括低压四元溶剂系统、自动进样恒温样本管理器、光电二极管矩阵检测器、ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)Empower3色谱工作站；XS-106DU电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多仪器公司，感量：0.01 mg)；BL15-60AA超声波清洗机(无锡沃信仪器制造有限公司)；RE-52AAC旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；YJ-100中药粉碎机(济南亿健医疗设备有限公司)；DHG鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)；DZF真空干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)；调温电热器(南通利豪实验仪器有限公司)。

1.2试药与试剂 乙腈(色谱纯，美国Honeywell Burdick﹠Jackson公司，批号：S15A1H)；乙酸(色谱纯，美国TEDIA公司，批号：17040594)；纯化水(杭州娃哈哈集团有限公司，批号：20180324)。标准物质或对照品：丹参素钠(批号：110855-201412，含量：98.1%)、原儿茶酸(批号：110809-201205，含量：99.9%)、丹酚酸B(批号：111562-201716，含量：94.1%)、迷迭香酸(批号：111871-201404，含量：90.5%)购自中国食品药品检定研究院；原儿茶醛[GBW09553，含量：(99.8±0.4)%)]、咖啡酸[GBW09529，含量：(99.5±0.7)%]、阿魏酸[GBW09518，含量：(99.8±0.5)%]、异阿魏酸[GBW09574，含量：(99.7±0.4)%]、丹酚酸A[含量：(99.1±0.4)%]购自中国医学科学院药物研究所；9‴丹酚酸B单甲酯(批号：MUST -17060205，含量：99.16%)、9’丹酚酸B单甲酯(批号：MUST-171114055，含量：99.38%)、丹酚酸C(批号：MUST- 17031402，含量：99.90%)、紫草酸(批号：MUST-17053003，含量：99.58%)、丹酚酸B二甲酯(批号：MUST-17041614，含量：90.04%)购自成都曼斯特生物科技有限公司。

不同批次的丹参样品分别购买自山东省莱芜市艾山、九龙、罗汉峪、密埠等地。经中国医学科学院药物研究所马辰研究员鉴定为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhizaBre.的干燥根及根茎。

2 方法与结果

2.1色谱条件 色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；柱温30 ℃；进样量：1 μL；检测波长286 nm；流动相：0.5%乙酸溶液(A)-乙腈(B)，流速：0.6 mL·min-1，梯度洗脱：0～1.02 min，90%→80%A；>1.02～4.08 min，80%→72%A；>4.08～4.76 min，72%→55%A；>4.76～5.50 min，55%→90%A；>5.50～8 min，90%A。

2.2溶液的制备

2.2.1对照品溶液的制备 分别称取丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛、咖啡酸、阿魏酸、异阿魏酸、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸A、丹酚酸C、9‴丹酚酸B单甲酯、9′丹酚酸B单甲酯、丹酚酸B二甲酯约10 mg，精密称定，加入80%甲醇溶液溶解并定容至10 mL，得到浓度依次为1.126，0.944，1.06，1.011，1.010，1.020，0.962，0.973，0.982，0.968，0.996，1.049，1.067，0.904 mg·mL-1的各对照品溶液作为储备液，其中原儿茶酸、丹酚酸C、9‴丹酚酸B单甲酯、9′丹酚酸B单甲酯、丹酚酸B二甲酯稀释10倍后作为对照品溶液，其余10种成分将储备液作为对照品溶液。精密量取上述储备液各1 mL至25 mL量瓶中，以80%甲醇溶液定容，摇匀，即得混合对照品溶液。

2.2.2供试品溶液的制备 称取样品粉末[过三号筛(50目，孔径355 μm±13 μm)]约1 g，精密称定，置于250 mL锥形瓶中，准确加纯化水100 mL，加热回流4 h，冷却过滤后将续滤液减压浓缩，放冷，并定容至25 mL，摇匀，即得。

2.3方法学验证

2.3.1专属性实验 取“2.2”项下对照品溶液与供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件进样，记录色谱图，见图1。

2.3.2线性关系考察 分别取“2.2.1”项下各储备液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL至50 mL量瓶中，定容，摇匀，得到5份梯度浓度的混合对照品溶液，按“2.1”中色谱条件进行分析，以各成分浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得到14种水溶性成分的线性方程及范围，见表1。

1.丹参素钠；2.原儿茶酸；3.原儿茶醛；4.咖啡酸；5.阿魏酸；6异阿魏酸；7.迷迭香酸；8紫草酸；9丹酚酸B；10.丹酚酸A；11.9‴丹酚酸B单甲酯；12.9′丹酚酸B单甲酯；13.丹酚酸C；14.丹酚酸B二甲酯。

图1 混合对照品(A)与丹参样品(B)的UPLC图

1.salvianic acid A sodium；2.protocatechuic acid；3.protocatechuic aldehyde；4.caffeic acid；5.ferulic acid；6.isoferulic acid；7.rosmarinic acid；8.alkannic acid；9.salvianolic acid B；10.salvianolic acid A；11.9‴saltanoic acid B monomethyl ester；12.9'salvianolic acid B monomethyl ester；13.salvianolic acid C；14.salvianolic acid B dimethyl ester.

Fig.1UPLCchromatogramofmixedreferencesubstance(A)andRadixSalviaeMiltiorrhizaesample(B)

2.3.3精密度实验 取“2.2.1”项下对照品溶液，按照“2.1”项下色谱条件连续进样6次，测得峰面积，14种成分RSD值处于0.19%～1.81%，小于2%，表明仪器精密度良好。

2.3.4稳定性实验 取上述“2.2.2”项下供试品溶液，分别于0，2，4，8，12，24 h进样测定峰面积，14种成分在各时间点的峰面积的RSD值处于0.57%～0.51%，小于2%，证明供试品溶液稳定性良好。

2.3.5重复性实验 取样品2(罗汉峪直径0.1～0.5 cm的丹参药材样品)，按照“2.2.2”项方法制备6份供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件进样检测，记录各成分峰面积，14种成分平均含量RSD值处于0.04%～1.24%，小于2%，表明方法重复性良好。

2.2.6回收率实验 称取样品2约0.5 g，精密称定，共称取6份，分别按照已知质量分数的100%，分别加入14种成分对照品，按照“2.2.2”项方法制备供试品溶液，按照“2.1”项色谱条件进样检测，计算各成分回收率，结果见表2。

2.3.7样品测定结果 分别取丹参的不同直径的样品(样品1-9，其中1-3号产自罗汉峪，4-6号产自艾山，7-9号产自密埠)、不同部位的样品(样品10-24，其中10-14号产自罗汉峪，15-19产自艾山，20-24号产自九龙)按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，每份样品制备3份，按照“2.3”项下色谱条件进样检测，记录各成分峰面积，按照外标法计算含量，不同直径丹参根中14种水溶性成分的平均含量见表3，丹参不同部位中14种水溶性成分的平均含量见表4～6。

表1 线性方程及范围

表2 14种水溶性成分回收率试验结果

Tab.2Resultsofrecoverytest14hydrophiliccomponentsn=6

成分名称样品量加入量测得量mg平均回收率/%丹酚酸A0.3250.3240.652100.93原儿茶醛0.2600.2600.522100.77咖啡酸0.0200.0200.039698.00阿魏酸0.2350.2350.46898.15异阿魏酸0.6700.6681.32798.35丹参素纳3.8153.8177.647100.39原儿茶酸0.0050.0050.010100.00丹酚酸B15.71515.71231.41999.95迷迭香酸0.7650.7651.51798.30丹酚酸C0.0100.0100.0201101.00紫草酸0.9850.9831.968100.009′丹酚酸B单甲酯0.0450.0450.089498.679‴丹酚酸B单甲酯0.0450.0450.090100.00丹酚酸B二甲酯0.1000.0100.0201101.10

3 讨论

3.1色谱条件 通过查阅文献[9-16]发现，测定丹参中水溶性成分的色谱条件中，流动相的有机相多为乙腈或者甲醇，非有机相多为乙酸溶液或磷酸溶液，柱温集中在20～40 ℃，波长范围在200～290 nm，为探求最合适的色谱条件，笔者对流动相(甲醇-0.5%乙酸溶液、乙腈-0.5%乙酸溶液、乙腈-0.1% 磷酸溶液)、波长(210，254，286 nm)、柱温(20，30，35 ℃)进行考察，当流动相为甲醇-0.5%乙酸溶液时，所测成分间的分离度较低，当流动相为乙腈-0.1% 磷酸溶液时，酸性较大的成分(如丹酚酸A)易产生拖尾，而流动相为乙腈-0.5%乙酸溶液时，峰形与分离度均较为理想；当波长为210 nm时，溶剂效应显著，当待测成分含量较低时易被溶剂峰掩盖，而波长为254 nm时，大部分成分的紫外吸收值变小，有些成分响应值甚至减小到286 nm下的一半，所以选定波长为286 nm；当柱温为20 ℃时，色谱峰出现前延，当柱温为35 ℃时，出峰时间太短，分离度欠佳，故最终选择的柱温为30 ℃；结合上述考察结果最终确定当流动相为乙腈-0.5%乙酸溶液，检测波长为286 nm，柱温30 ℃时各成分的分离效果及峰形最好。

3.2不同直径与部位对丹参药材中水溶性成分含量的影响 本文对产自罗汉峪、艾山、密埠的不同直径和不同部位的丹参药材进行提取分析，探索了不同直径和不同部位的丹参中水溶性成分的种类和含量，并采用了两因素析因设计的方差分析，探究了丹参直径和部位与水溶性成分含量之间的相关关系和影响因素间的交互作用。

表3 不同直径丹参根含量测定结果

Tab.3Resultsofcontentdeterminationofsalviamiltiorrhizarootwithdifferentdiametermg·g-1，n=3

样品编号丹参根编号(直径/cm)1(≤0.1)2(0.1～0.5)3(0.5～1.0)4(≤0.1)5(0.1～0.5)6(0.5～1.0)7(≤0.1)8(0.1～0.5)9(0.5～1.0)丹酚酸A0.110.500.380.650.650.430.441.430.69原儿茶醛0.020.040.050.020.520.050.781.110.85咖啡酸0.070.060.060.020.040.030.050.050.00阿魏酸0.220.330.300.360.470.380.310.450.28异阿魏酸0.771.230.990.571.341.030.861.180.89丹参素纳3.574.584.566.117.636.224.086.844.29原儿茶酸0.120.190.180.100.010.150.180.010.15丹酚酸B17.9234.8032.9831.6931.4334.4621.4433.6631.38迷迭香酸0.221.151.021.611.531.250.991.730.92丹酚酸C0.020.030.030.030.020.030.030.050.05紫草酸0.821.384.681.861.971.311.262.271.319′丹酚酸B单甲酯0.040.030.000.050.090.000.080.230.309‴丹酚酸B单甲酯0.000.030.000.020.090.000.050.230.25丹酚酸B二甲酯0.260.090.070.170.200.180.280.540.69总量24.1844.4345.2843.2846.0045.5130.8449.7842.06

表4 罗汉峪丹参不同部位含量测定结果

Tab.4ResultsofcontentdeterminationofdifferentpartsofsalviamiltiorrhizafromLuohanyumg·g-1，n=3

成分罗汉峪丹参编号和部位10根11茎12叶13木质部14周皮丹酚酸A1.040.031.090.161.11原儿茶醛1.250.290.670.470.21咖啡酸0.320.390.850.030.03阿魏酸0.400.230.590.180.44异阿魏酸1.350.351.030.641.34丹参素钠9.151.937.682.866.38原儿茶酸0.150.180.180.000.00丹酚酸B36.110.422.824.9718.18迷迭香酸0.410.372.080.401.82丹酚酸C0.120.030.030.030.12紫草酸1.470.322.290.731.889′丹酚酸B单甲酯0.090.000.080.030.219‴丹酚酸B单甲酯0.190.030.470.030.11丹酚酸B二甲酯0.691.200.610.510.98总量42.745.7320.4611.0132.80

表5 艾山丹参不同部位含量测定结果

Tab.5ResultsofcontentdeterminationofdifferentpartsofsalviamiltiorrhizafromAishanmg·g-1，n=3

成分艾山丹参编号和部位15根16茎17叶18木质部19周皮丹酚酸A0.280.110.140.562.19原儿茶醛0.660.381.980.991.21咖啡酸0.250.560.810.030.03阿魏酸0.210.280.520.360.44异阿魏酸0.780.560.460.991.16丹参素钠4.442.855.825.839.08原儿茶酸0.150.240.350.080.00丹酚酸B37.872.431.4716.8933.63迷迭香酸0.181.181.811.191.68丹酚酸C0.030.030.030.030.08紫草酸0.920.621.232.012.469′丹酚酸B单甲酯0.070.030.000.330.289‴丹酚酸B单甲酯0.120.130.000.060.19丹酚酸B二甲酯0.400.560.861.082.44总量46.349.9415.4730.4354.88

3个产地共27份样品的分析结果表明，相同产地不同直径的丹参药材中，直径范围在0.1～0.5 cm的丹参中各水溶性成分含量最高，统计数据显示直径是影响14种水溶性成分含量的重要因素(除紫草酸和丹酚酸C以外，其余成分方差分析的F>3.8，P<0.05)，且3个产地的样品均呈现此规律。在所有直径范围内的丹参样品中丹酚酸B含量最高，其次是丹参素，9‴丹酚酸B单甲酯与9’丹酚酸B单甲酯则含量都比较低。

表6 九龙丹参不同部位含量测定结果

Tab.6ResultsofcontentdeterminationofdifferentpartsofsalviamiltiorrhizafromJiulongmg·g-1，n=3

成分罗汉峪丹参编号和部位20根21茎22叶23木质部24周皮丹酚酸A2.010.040.170.081.17原儿茶醛1.480.060.470.180.74咖啡酸0.410.220.800.030.05阿魏酸0.510.170.550.230.33异阿魏酸1.380.320.490.901.17丹参素钠8.132.144.384.464.75原儿茶酸0.230.200.470.050.00丹酚酸B31.330.991.3017.9534.02迷迭香酸0.610.250.831.191.12丹酚酸C0.200.000.000.030.08紫草酸2.230.150.921.901.619′丹酚酸B单甲酯0.320.000.000.030.339‴丹酚酸B单甲酯0.370.000.000.090.28丹酚酸B二甲酯0.560.082.100.671.28总量49.764.6212.4627.7846.94

3个产地共45份样品的统计数据分析表明，相同产地丹参不同部位的各水溶性成分含量存在显著差异(F>10.0，P<0.05)。从具体成分来看，根中最多成分是丹酚酸B，其含量是茎中的50倍，叶中的10～20倍；茎叶中丹参素所占比例最高，含量最大可达7.86 mg·g-1。在所检出14种水溶性成分中，原儿茶酸、咖啡酸、迷迭香酸和紫草酸的含量从多到少依次为叶、根、茎，其中叶中迷迭香酸的含量达到了根茎含量的5～10倍，丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、阿魏酸、异阿魏酸、丹酚酸B、丹酚酸A、丹酚酸C、9‴丹酚酸B单甲酯、9’丹酚酸B单甲酯、丹酚酸B二甲酯的含量以及所有成分的总量从多到少依次为根、叶、茎，其中根的丹参素含量是茎中的4倍，是叶中1.5～2倍。周皮中各成分的含量均大于木质部，此外原儿茶酸主要存在于木质部，周皮中含量为零，丹酚酸A在周皮中的含量是木质部中4～10倍，周皮中的水溶性成分总量大于木质部。

丹参的部位和根的直径会影响到丹参中水溶性成分的含量，直径为0.1～0.5 cm丹参根所含各种水溶性成分均较高，总量上也表现出优势，茎叶中水溶性成分总量大大低于根，除丹参素外，其余单个成分含量也低于根；罗汉峪和艾山的样品中，丹参根的周皮较之木质部在水溶性成分的含量上表现出明显的优势，这也与其0.1～0.5 cm直径范围内，比表面积大，水溶性成分含量高的现象相对应，至于须根(直径小于0.1 cm)为什么没有表现出该优势，推测可能是须根作为土壤中吸收水分和养分的最前沿，不能有效储存合成的有机物，而是将其输送到了主根及其他部位[17]。

使用UPLC法同时检测14种水溶性成分，经方法学验证后证明该方法分离度好，灵敏度高，定量准确，同时具有分析时间短，节约资源的优点，可为丹参资源的开发利用和质量控制提供参考。