祛白颗粒对氢醌诱导白癜风小鼠的疗效*

杨爱霞，徐蕾，张力凡

(1.武汉市第一医院药学部，武汉 430022；2.湖北中医药大学药学院，武汉 430065)

白癜风患病率为0.1%～2%[1]，是由皮肤黑色素合成功能丧失或减退导致，临床表现为皮肤色素脱失，为常见的后天性皮肤病，常常影响患者的生理及心理健康。白癜风病因复杂，尚未明确，从中医角度来看，目前有气血失和、气血瘀滞、肝肾不足、肝郁气滞学说；从西医角度来看，目前有自身免疫学说、遗传因素、黑素细胞自毁学说、微量元素学说、神经化学因素、黑素细胞凋亡异常学说。中医认为白癜风的发生为风邪外袭、气血失调，与心、肝、脾、肺等脏器有关[2]。祛白颗粒共包含9种中药，其中：蒺藜[3]、钩藤，散结祛瘀、清热平肝；鸡血藤、夜交藤，补血造血、祛风通络；生地、牡丹皮、赤芍，清热凉血、活血化瘀；当归、丹参，补血活血、清心祛瘀。因此本方从中医角度具有清心养肝、调养气血、消风解瘀、凉血祛斑的功效。本研究通过制造白癜风小鼠模型并给予祛白颗粒治疗，之后通过皮肤复色评分、病变组织病理学检测、血清相关蛋白酶检查，了解祛白颗粒治疗小鼠白癜风模型的疗效。

1 材料与方法

1.1试剂 丹皮酚(中国食品药品检定研究院，批号：201407，含量：96.8%)；阿魏酸(中国食品药品检定研究院，批号：201614，含量：97.3%)；2，3，5，4-四羟基二苯乙烯葡萄糖苷(北京中科质检生物技术有限公司，批号：201311，含量：≥98%)；对苯二酚(国药集团化学试剂有限公司，批号：20170704，AR)；羧甲基纤维素钠800-1200(国药集团化学试剂有限公司，批号：F20090916，CP)；胆碱酯酶(cholinesterase，ChE，上海酶联生物科技有限公司，批号：E20180701-28436B)；单胺氧化酶 (monoamine oxidase，MAO，上海酶联生物科技有限公司，批号：E20180702-28367B)；酪氨酸(tyrosinase,TYR)试剂盒(上海酶联生物科技有限公司，批号：E20180703-20470B)；祛白颗粒(武汉市第一医院实验室自制，批号：20180302)。

1.2仪器 电子天平(BS124S，北京赛多利斯仪器系统有限公司，感量：1 mg )；pH酸度计(上海仪电科学仪器)；MK3型酶标仪(热电上海仪器有限公司)，85-2型恒温磁力搅拌器(上海司乐仪器有限公司)。

1.3实验动物 C57BL小黑鼠，级别SPF，体质量(18±2)g，雌性，由湖北省实验动物研究中心提供。合格证号：42000600028197，许可证号：00269039。饲养于武汉市第一医院动物实验室，实验室温度(20±2) ℃，相对湿度(40±10)%，实验动物使用许可证号：SYXK(鄂)2015-0018，No：00264380；实验动物从业人员上岗证：W20180224。

1.4动物造模

1.4.1造模原理 TYR是一种含铜的氧化酶，催化酪氨酸转化为多巴，多巴转化为多巴醌，在黑色素的形成中发挥作用，是黑色素合成的限速酶。氢醌制备白癜风模型的原理为阻断TYR催化酪氨酸生成黑色素[4]，也有认为氢醌通过进入黑素细胞产生细胞毒性，从而抑制黑色素生成[5]。

1.4.2造模方法 小鼠51只，采用随机数字表法分为5组：正常对照组、模型对照组和祛白颗粒小剂量组、中剂量组各10只，大剂量组11只。对模型对照组和祛白颗粒小剂量组、中剂量组、大剂量组小鼠进行造模制备白癜风模型。选择小鼠颈背部黑色部位2 cm×2 cm造模，电动剃毛刀脱毛，每日在背部脱毛区均匀涂抹2.5%氢醌软膏[5-7](羧甲基纤维素钠1 g与氢醌2.5 g溶于去离子水100 mL中)，电磁搅拌1 h，正常对照组小鼠每日于背部脱毛处涂抹空白基质(羧甲基纤维素钠1 g溶于100 mL去离子水中)0.5 mL，持续60 d。在此期间，各组小鼠每5天脱毛1次。造模每10天对造模区域进行摄像，记录皮肤脱色情况，并对造模情况进行评分。评分标准：0分，造模处肤色较脱色前色素减退不明显；1分，造模处肤色较脱色前出现轻微色素减退；2分，造模处肤色出现明显色素减退或出现实验区皮肤上少量毛发变白；3分，造模处肤色苍白或出现明显的毛发变白。评分为3分表示造模成功[8]。在试验过程中，模型对照组、祛白颗粒小剂量组、中剂量组小鼠各死亡1只。

1.5给药 按剂量分别灌胃给药，给药的容积为20 mL·kg-1，每天 1 次，连续灌胃40 d。按照小鼠体质量计算每日服药量，根据Meeh-Runer公式，60 kg成人用药量换算为小鼠用药量为：成人用量(g·kg-1)×9.01×W小鼠(成人体质量按60 kg计算)。治疗组分别按照该剂量的0.5，1，2倍作为祛白颗粒小、中、大剂量组。祛白颗粒小剂量组：1.955 17 g·kg-1；祛白颗粒中剂量组：3.910 34 g·kg-1；大剂量组：7.820 68 g·kg-1；灌胃量0.5 mL[7]。造模第20天开始分组灌胃。正常对照组和模型对照组每天灌胃0.5 mL纯净水，小剂量组、中剂量组、大剂量组分别按剂量进行灌胃。

1.6观测指标

1.6.1复色观察 选取造模成功动物开始灌胃给药，每10 d对实验动物进行摄像评估，观察造模部位色素沉着情况，实验结束后观察造模部位肤色变化并评分评价整体的治疗有效率[8]。评分标准：3分，造模区呈深褐色或黑色，色素基本恢复正常；2分，造模区为中褐色或浅灰色、色素恢复面积>50%；1分，造模区为淡褐色、色素恢复面积<50%；0分，造模区皮肤呈白斑状或苍白。有效率(%)=(3分数+2分数)/总数×100%。

1.6.2病理切片 实验结束后处死小鼠，取造模处皮肤约1 cm×1 cm，多聚甲醛固定，石蜡包埋。每张切片取皮肤纵切面、横切面各两张。分别进行HE染色，显微镜下观察纵切面各组黑色素分布情况；扫描横切面，用CaseViewer在相同放大倍数下每个视野中棘层黑色素毛囊、基底层黑素、含黑素颗粒表皮细胞[6，9]的数量。

1.6.3生化指标 文献报道白癜风的发生与体内血清TYR、ChE、MAO[7]活性有关，第40天灌胃1 h后麻醉小鼠，取眼眶血0.5～0.8 mL，低温离心(5000×g)10 min后小心吸取血清共约0.3 mL，按照酶联免疫吸附测定(ELISA)法试剂盒说明书测定TYR、MAO、ChE含量。

2 结果

2.1小鼠脱色与复色结果评定 正常对照组小鼠背部皮肤在此期间无变化，模型对照组小鼠皮肤出现脱色、白斑且伴随非造模区域毛发变白无光泽现象。灌胃治疗结束后，与模型对照组比较，祛白颗粒小、中、大剂量组背部皮肤出现色素沉着，毛发逐渐由白色变为棕色、黑色，见图1。祛白颗粒小、中、大剂量组治疗有效率分别为44.4%，66.7%，81.2%，与模型对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。

2.2小鼠黑色素细胞计数及病理切片观察 见图2。从小鼠皮肤纵切片可以看出，正常对照组表皮无增生，表皮及毛囊细胞有大量黑色素颗粒；模型对照组小鼠表皮细胞及毛囊细胞中黑色素颗粒明显较少，且表皮增生，毛囊数量减少；祛白颗粒小、中、大剂量组表皮均有一定程度的增生，但黑色素颗粒及毛囊数量随给药剂量的增加而增加。扫描切片计数皮肤中黑色素毛囊、基底层黑素细胞、含黑素颗粒表皮细胞得知，祛白颗粒对小、中、大剂量组小鼠的治疗效果呈剂量依赖性。见表2。

2.3生化指标 给予不同剂量祛白颗粒治疗40 d后，与正常对照组比较，其余组小鼠血清中TYR、ChE活性降低，MAO活性升高。与模型对照组比较，祛白颗粒小、中、大剂量组TYR、ChE活性增加(P<0.01)，MAO活性得到抑制(P<0.01)，且与给药剂量呈正相关。见表3。

3 讨论

祛白合剂为医院经方，运用于患者后其临床症状均有不同程度的改善与消失，疗效确切，此前的临床使用中观察到治疗局限性白癜风总有效率为86.8%[10]，且未发现不良反应，值得推广。然而中药煎剂味苦、不易携带、熬制方法繁复，患者顺应性较差。逐渐发展的中药颗粒剂能有效纠正中药煎剂的缺点，为患者提供便利。笔者在前期的课题研究中把祛白合剂制成了质量可控的祛白颗粒，本实验旨在运用动物模型验证祛白颗粒的作用效果，并分析其作用机制[11]。此次实验中发现祛白颗粒对白癜风小鼠的作用效果呈现量-效关系，治疗组小鼠黑色素颗粒、毛囊数及治疗总有效率均有明显增加，且治疗组小鼠血清中的MAO、YTR、ChE均区别于模型对照组。交感神经兴奋致MAO活性增强导致过氧化氢聚集从而抑制黑色素生成量；ChE活性增强使得突触间乙酰胆碱减少从而抑制黑色素生成[8]。另有文献指出，丙二醛(MDA)、白细胞介素-6(IL-6)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)[5，12]可能与白癜风的发生有一定关系，这些酶可能参与调控白癜风的发生过程。生化指标间接反映模型动物体白癜风的发生、发展及治疗过程，是攻克白癜风重要参考标准。然而，由于祛白颗粒所含的化学成分复杂多样，其具体作用成分及作用机制尚无法解释，且白癜风病因尚未明确，目前也仅有3种基因收录到数据库中。近年西医以单一成分-单一靶点[13]的思路研究中药，这难以阐述中医药各个单味药互相作用相辅相成的观念。寻找中药复方优选组分，规避中药的盲目性符合现代中医药发展需要[14-15]。另外，运用网络药理学分析中药的作用机制受到诸多学者的关注，王吉烨等[16]运用admetSAR和 bSDTNB建立中药-活性化成分-靶点-生物学过程-体液模型，基于粘液质理论分析了几种维吾尔药治疗白癜风的作用机制，且推断并验证了山柰素和异鼠李素对白癜风的治疗作用。按照网络药理学的思路，在后续的实验中，笔者将运用网络药理学找出分析祛白颗粒的活性成分及作用靶点，分析出祛白颗粒中的单一成分治疗白癜风的作用效果，试图找寻白癜风的作用靶点及生物学过程，明确白癜风发病机制，从而了解疾病本质，进而辩证、协调用药。

A.正常对照组；B.模型对照组；C.祛白颗粒小剂量组；D.祛白颗粒中剂量组； E.祛白颗粒大剂量组。

A.normal control group; B.model control group; C.low-doseQubaigranule group; D. medium-doseQubaigranule group; E. high-doseQubaigranule group.

Fig.1Backskinsoffivegroupsofmice

表1 5组小鼠的祛白颗粒治疗效果比较

Tab.1ComparisonoftherapeuticeffectofQubaigranuleamongfivegroupsofmice

组别小鼠/只评分/只3分2分1分0分总有效率/%P值正常对照组1010000100.0-模型对照组9013511.1∗1-祛白颗粒 小剂量组9045044.4∗20.002 中剂量组9153066.7∗20.000 大剂量组11272081.2∗20.000

与正常对照组比较，*1P<0.01；与模型对照组比较，*2P<0.01。

Compared with normal control group，*1P<0.01；compared with model control group，*2P<0.01.

表2 5组小鼠黑色素毛囊、基底层黑素细胞、含黑素颗粒表皮细胞计数比较

组别黑色素毛囊基底层黑素细胞含黑素颗粒表皮细胞正常对照组109.67±18.93135.67±6.03164.33±11.93模型对照组34.33±9.02∗164.67±14.05∗163.00±7.94∗1祛白颗粒 小剂量组62.33±10.8986.33±11.2486.33±9.45 中剂量组89.00±12.29∗2104.00±6.00∗2103.33±12.50∗2 大剂量组91.67±16.07∗3117.33±23.46∗3138.00±18.52∗3

与正常对照组比较，*1P<0.01；与模型对照组比较，*2P<0.05，*3P<0.01。

Compared with normal control group，*1P<0.01；compared with model control group，*2P<0.05，*3P<0.01.

A.正常对照组；B.模型对照组；C.祛白颗粒小剂量组；D.祛白颗粒中剂量组； E.祛白颗粒大剂量组。

A.normal control group; B.model control group; C.low-doseQubaigranule group; D. medium-doseQubaigranule group; E. high-doseQubaigranule group.

Fig.2Longitudinalsectionofskinsinfivegroupsofmice(HEstaining，×200)

表3 5组小鼠血清 TYR、ChE、MAO水平的比较

组别小鼠/只TYR/(μmol·L-1)ChEMAO(ng·mL-1 )正常对照组1011.1103±1.01381.5749±0.18572.1357±0.1959模型对照组93.7224±0.5789∗12.9234±0.2609∗13.6243±0.1002∗1祛白颗粒 小剂量组94.9661±0.7389∗22.4451±0.2035∗22.8724±0.3052∗2 中剂量组96.1795±0.8469∗22.2501±0.2852∗22.5800±0.3763∗2 大剂量组118.7126 ±0.5925∗22.0005±0.2796∗22.4455±0.1325∗2

与正常对照组比较，*1P<0.01；与模型对照组比较，*2P<0.01。

Compared with normal control group，*1P<0.01；compared with model control group，*2P<0.01.