马铃薯S 病毒胶体金免疫层析试纸条的研制

张微 李志新 付春江 刘卫平

（黑龙江省农业科学院克山分院，齐齐哈尔 161600）

马铃薯 S 病毒（Potato virus S，PVS）也称为马铃薯潜隐病毒，该病毒主要通过接触和蚜虫带毒传播，感染此病毒可使马铃薯质量和产量严重降低。该病毒分布范围十分广泛，在所有马铃薯种植区都发生。PVS 单独侵染马铃薯，产生的症状较轻微，甚至不表现出症状，产量降低10%-20%［1］。在田间PVS 常与其他病毒混合侵染，造成严重危害［2］。目前，对PVS 病的防治，主要是通过筛选种植抗病品种，利用茎尖脱毒方法进行脱毒苗的繁育，生产脱毒种薯等。PVS 的脱毒很困难，因此通过病毒检测技术，对种薯PVS 进行快速、灵敏检测对生产高质量种薯是十分必要的。传统的检测方法包括电子显微镜、DAS-ELISA 和PCR 等［3-5］，但此类方法在生产应用中存在一定的局限性［6］。胶体金免疫层析技术（Goldimmunochromatography assay，GICA） 是 利用免疫层析原理，将胶体金标记、免疫检测、层析分析、单（多）克隆抗体和新材料等结合在一起的技术，具有操作简便、快速、结果准确、无须专业技术人员与特殊设备等优点［7］，在医学、动植物检疫、食品安全监督等领域得到广泛应用［8-11］。在马铃薯上，魏梅生等已研制出马铃薯X 病毒和马铃薯Y 病毒胶体金检测试纸条［12］。但关于PVS 快速检测试纸条的研究未见报道，本研究制备具有使用简便、反应灵敏等特点的PVS 检测试纸条，以适应基层工作的实际需求。

1 材料与方法

1.1 材料

PVS，马 铃 薯X 病 毒（Potato X virus，PVX）、马铃薯Y 病毒（Potato Y virus，PVY）、马铃薯卷叶病毒（Potato leaf roll virus，PLRV），马铃薯M 病毒（Potato M virus，PVM），马 铃 薯A 病 毒（Potato A virus，PVA）毒原均为本实验室保存。田间供试马铃薯品种为“克新13 号”。

PVS 羊源多克隆抗体购买于美国Agida 公司。兔抗羊抗体购北京百奥莱博科技有限公司，氯金酸购自天津市光复精细化工研究所。柠檬酸三钠、牛血清白蛋白购自哈尔滨欣科瑞有限公司。硝酸纤维素膜（Nitrocellulose membrane，NC 膜）、玻璃纤维膜、样品垫、吸水纸、支持板、三维大平面点膜喷金仪、裁条机、微电脑自动斩切机均购自上海金标生物科技有限公司。DAS-ELISA 检测试剂盒购买于美国Agida 公司。其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 胶体金的制备、鉴定 采用氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备胶体金。取297 mL ddH2O 于圆底烧瓶中，加入3 mL 1% HAuCl4·4H2O 混匀。将圆底烧瓶置于电热套式恒温器中，加入干净搅拌子，低速搅拌加热至沸腾，迅速一次性加入3 mL 1% 柠檬酸三钠，继续煮沸，观察颜色变化。由浅黄色→黑色→紫色→紫红色，当完全转变成红色时，继续煮沸5 min 后停止加热，补水至原体积。将烧制的胶体金溶液用蛋白核酸分析仪（Gene Spec V，日本日立）进行全波长扫描鉴定，并置于透射电镜（H7650，日本日立）下观察，拍照。

1.2.2 免疫胶体金试纸条制备工艺优化

1.2.2.1 金标垫 主要对金标抗体的标记量，反应pH 值，封闭时间、离心时间、复溶液使用量等进行优化。取6 支干净的1.5 mL 离心管，分别加入1 mL胶体金，然后分别加入5 μL 1 mg/mL PVS 抗体，再加入1 μL、2 μL、3 μL、4 μL、5 μL、6 μL 0.2 mol/L K2CO3调节pH，混匀后室温静置反应30 min，观察颜色变化。根据颜色和沉淀量判定免疫胶体金标记抗体的最适pH。另取8 支干净的1.5 mL 离心管，分别加入1 mL 胶体金，然后分别加入1 μL、2 μL、3 μL、4 μL、5 μL、6 μL、7 μL、8 μL 1 mg/mL PVS抗体，再加入2 μL 0.2 mol/L K2CO3调节pH，混匀后室温静置反应30 min，观察颜色变化。根据颜色和沉淀量判定免疫胶体金标记抗体的最适抗体量。标记了胶体金后的抗体加入10% BSA 100 μL 设置不同时间，分别为10 min、20 min、30 min、40 min、50 min 进行封闭，选择不同离心时间，分别为10 min、20 min、30 min、40 min、50 min 进行离心，留沉淀弃上清，用复溶液复溶沉淀至合适的比例，用喷金仪器设置不同的喷金量，分别为5 μL/cm、6 μL/cm、7 μL/cm、8 μL/cm、9 μL/cm、10 μL/cm 喷在玻璃纤维纸上，制作金标垫。

1.2.2.2 检测线和质控线 将PVS 抗体用超滤管（Millipore，10 kD）浓缩至1.0 mg/mL，将硝酸纤维素膜（NC 膜）固定贴合于支持板上，使用三维平面点膜喷金仪，T 线划膜量设置为0.5 mg/mL、0.6 mg/mL、0.7 mg/mL、0.8 mg/mL、0.9 mg/mL、1.0 mg/mL、1.1 mg/mL、1.2 mg/mL 将抗体划线于NC 膜上，作为检测线（Testline，T 线）。用0.02 mol/L 磷酸缓冲液（PBS，pH 7.4）将羊抗兔抗体稀释至1.0 mg/mL，C线划膜量设置为0.5 mg/mL、0.6 mg/mL、0.7 mg/mL、0.8 mg/mL、0.9 mg/mL、1.0 mg/mL、1.1 mg/mL、1.2 mg/mL 分别划线于NC 膜上，作为质控线（Controlline，C 线），37℃烘干4 h 以上。

1.2.3 试纸条的组装 将样品垫，金标垫，吸水纸组装到附有NC 膜的支持板上，然后用切条机切割成3.5 mm 宽的试纸条。

1.2.4 试纸条的检测方法与结果判读 将带有胶体金复合物的一端插入检测样品液中，2 min 左右判断结果。若试纸条仅C线出现紫红色线而T线未显色，结果为阴性；若试纸条上C线和T线均出现紫红色，结果为阳性；若试纸条C线和T线都没有显色，则说明此试纸条已经失效，结果无效。

1.2.5 试纸条的质量检测

1.2.5.1 特异性测试 分别将PVS、PVX、PVY、PLRV、PVM 和PVA 阳性材料用2 mL 的PBS 缓冲液混匀，制成样品检测液，将制备好的试纸条置于样品中检测，每种病毒重复检测3 次。

1.2.5.2 灵敏度测试 取PVS 阳性样品进行倍比稀释获得10、102、103、104和105倍的样品稀释液，分别用试纸条进行灵敏度检测。

1.2.5.3 马铃薯样品检测 从田间采集马铃薯叶片54 份，按1∶10（W/V）加入PBS 缓冲液研磨成浆，为检测样品。首先采用试纸条检测，再通过DASELISA，按照试剂盒使用说明书进行检测，若样品孔显现黄色，结果为阳性，若样品孔呈现无色透明，结果为阴性。将两种检测结果进行对比分析。

1.2.5.4 稳定性测试 将试纸条放在有干燥剂的铝箔袋中，密封保存在 4℃冰箱中；密封保存在室温下；敞开保存在室温下；分别设置不同保存时间，检测试纸条有效性。

2 结果

2.1 胶体金颗粒

制备好的胶体金在紫外波长524 nm 处有最大吸收峰，其金颗粒分布均匀，形状为球形或椭球形，直径大小20-30 nm（图1）。

2.2 胶体金试纸条制备条件优化

经过试验，制备金标抗体的最佳反应条件为加入0.2 mol/L K2CO34 μL 调节PH，PVS 抗体加入量为4 μL，封闭时间为30 min，离心时间30 min，100 μL 复溶液复溶沉淀。胶体金标记抗体喷涂量为6 μL/cm，T 线PVS 抗体浓度为1.0 mg/mL，C 线羊抗兔抗体浓度为1.0 mg/mL，T 线与C 线划膜量均为0.8 μL/cm。

图1 胶体金形态

2.3 试纸条特异性

试纸条对PVS 阳性样品的检测结果为阳性，对PVX、PVY、PLRV、PVM 和PVA 的阳性样品的检测结果为阴性，说明本试纸条具有非常好的特异性（图2）。

图2 试纸条对6 种病毒的特异性检测

2.4 试纸条灵敏度

试纸条对稀释1、10、102、103、104和105倍的带有PVS 的样品进行检测，结果（图3）发现试纸条可检测出稀释至104倍的PVS 汁液。

2.5 试纸条与DAS-ELISA检测样品的一致性分析

从田间采集马铃薯叶片54 份，经试纸条检测，结果5 份为阳性，49 份为阴性，再用DAS-ELISA 方法确认，两者结果相符（图4）。

2.6 试纸条稳定性

图3 试纸条对带有PVS 汁液的马铃薯样本灵敏度检测

将试纸条放在有干燥剂的铝箔袋中密封，放在4℃冰箱中保存，有效期可达180 d，能够保持原来检测的灵敏度；试纸条密封后，室温保存，有效期大于60 d，检测灵敏度有所下降；试纸条在室温下敞开保存，15 d 就失去了检测能力。说明在适当条件下保存，本试纸条具有较好的稳定性（图5）。

3 讨论

图4 54 份田间采集马铃薯样品检测结果

图5 试纸条稳定性测试结果

随着我国马铃薯主粮化战略的推进，马铃薯的质量与产量问题越来越受到关注与重视，我国是马铃薯生产大国，种植面积和总产量均占世界之首，但是，我国马铃薯单产水平较低。造成马铃薯单产低的一部分原因就是由马铃薯病毒病引起的。种植带有病毒病的马铃薯，种薯逐年就会发生严重退化，使得马铃薯质量差，产量低。为了减少马铃薯种薯的带毒率，对马铃薯种薯进行病毒检测是防病毒的关键环节。在我国，危害马铃薯的主要病毒有6 种，其中，PVS 是主要病毒之一。目前，对PVS 的检测，传统的方法就是DAS-ELISA，RT-PCR 方法也逐渐开始通用，但这2 种方法均需要在实验室进行，试验过程繁琐，需要专业的技术人员操作完成，检测时间较长，并不适宜大田对PVS 病的现场检测与普遍应用。很多马铃薯种植企业和大户不具备实验室检测的条件，建立一种使用简便，反应快速的针对PVS 的检测方法，是基层开展对马铃薯PVS 病检测的迫切需求。

本试验的目的是建立PVS 胶体金免疫层析试纸条检测的方法，通过优化试纸条的制备条件，研制出马铃薯S 病毒胶体金免疫层析检测试纸条。经过田间取样测试，本试纸条与DAS-ELISA 对PVS 的检测结果完全吻合，说明本试纸条准确性较高。已有研究表明检测PVX 和PVY 的试纸条检测样品的反应时间在10 min 之内，低温保存时间大于90 d，室温保存时间大于30 d［12］。本试纸条检测反应快捷，2 min 左右就能判断结果，节约了检测时间。低温保存时间超过180 d，室温保存时间可达60 d，试纸条的稳定性显著提高。虽然试纸条在检测灵敏度上，不如RT-PCR 方法，但是可以达到对病毒种类的定性筛选，对于田间病害的调查和试验条件差的企业具有良好应用价值。

4 结论

该检测方法具有使用简单方便、检测快捷、适用性广、特异性和灵敏度高、稳定性强的特点。作为一种快速筛查的手段，可用于广大基层单位开展马铃薯S 病毒的检测，为脱毒种薯的定级、病毒的防控提供技术支持。能够帮助解决种薯质量差、产量低等问题，具有广阔的市场前景。