“清香”绿茶的挥发性成分及其关键香气成分分析

王梦琪，朱 荫*，张 悦，施 江，林 智，吕海鹏*

（1.农业部茶树生物学与资源利用重点实验室，中国农业科学院茶叶研究所，浙江 杭州 310008；2.中国农业科学院研究生院，北京 100081）

香气是评价茶叶品质最重要的因子之一。所谓茶香，实质是不同芳香物质以不同的浓度组合，并对嗅觉神经综合作用所形成的茶叶特有香型[1]。实践表明，“清香”是绿茶香气中典型的香型之一，也是绿茶香气品质优异的重要感官评价特征[2-3]。例如，龙井茶（GB/T 18650—2008《地理标志产品 龙井茶》）、庐山云雾（GB/T 21003—2007《地理标志产品 庐山云雾茶》）、黄山毛峰（GB/T 19460—2008《地理标志产品黄山毛峰茶》）及信阳毛尖（GB/T 22737—2008《地理标志产品 信阳毛尖茶》）等名优绿茶，其国家标准感官审评方法中均以“清香”作为重要的等级评价标准之一。可见，“清香”是我国名优绿茶的香气评语中最为常见的品质特征之一，其化学本质具有重要的研究价值和研究意义，然而目前关于绿茶“清香”化学物质基础的研究比较薄弱，尚未揭示其关键呈香成分。

目前，从茶叶挥发性成分中鉴定出的香气成分已多达700余种，随着分析技术水平的不断提升，鉴定出的挥发性化合物将越来越多，例如，全二维气相色谱-飞行时间质谱（two-dimensional gas chromatography-timeof-flight-mass spectrometry，GC×GC-TOFMS）技术在茶叶香气的分析和鉴定上具有强大的优势[4]。然而，并非所有香气物质都对茶叶香气品质具有贡献作用，而是存在少量对呈香起到重要作用的关键香气成分，它们对茶叶的香气品质具有重要影响[5]。目前，食品中关键香气成分的分析鉴定方法主要包括气相色谱-嗅闻（gas chromatography-olfactometry，GC-O）法和香气活性值（odor activity value，OAV）法等。其中，GC-O直接强度法是通过嗅闻人员使用可变电阻器的移动记录气味随时间变化的强度，是一种判别关键香气成分的有效方法；而OAV是指气味化合物浓度与其对应介质中气味阈值的比值，能确切的评价单一香气成分对整体香气的贡献作用，一般认为OAV不小于1的物质对整体香气的呈现有贡献作用，OAV越大，说明该化合物对呈香越重要。

随着研究的不断深入，不同类别茶叶中的关键香气成分陆续被揭示，例如陈合兴[6]研究发现2,3-丁二酮、2-戊基呋喃等29 种物质是洞庭碧螺春茶的主要特征性香气成分；葛晓杰等[7]研究发现芳樟醇、苯甲醛等6 种成分是“花香”和“甜香”这2 种香型红茶的关键呈香成分；苗爱清等[8]研究发现铁观音的关键呈香成分为芳樟醇、己酸-(Z)-3-己烯酯和α-法尼烯等；Lv Haipeng等[9]研究发现1,2,3-三甲氧基苯等化合物是决定普洱茶独特“陈香”的关键化合物成分；Zhu Yin等[10]研究发现乙基苯、庚醛等8 种关键呈香成分影响绿茶“栗香”品质。上述结果为茶叶风味品质化学的研究提供了重要的科学理论依据。

茶叶香气主要来源于鲜叶及后期加工，茶树品种作为茶叶香型形成物质基础，是决定茶叶香型的最主要因素之一[11]，而绿茶类型及加工工艺的差异都会对茶叶香气品质的形成产生重大影响。因此，为了揭示茶叶“清香”品质的化学物质基础及其关键香气成分，本研究根据生产实践并参考文献[11]，拟选用一批适宜制作“清香”绿茶的茶树品种，并将其鲜叶原料按照相同的工艺加工成绿茶样品；进而选择“清香”品质具有代表性绿茶样品为研究对象，采用GC×GC-TOFMS技术分析其挥发性成分组成，并结合GC-O-MS实验和OAV分析等研究绿茶“清香”的关键香气成分，旨在为绿茶“清香”香气品质的科学评价和提高绿茶香型定向加工技术提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 绿茶样品的筛选

选用15 个不同的茶树品种，在2016年春季采摘一芽二叶茶鲜叶，并按照相同的工艺加工成烘青绿茶。具体加工工艺为：一芽二叶鲜叶→摊放（4 h）→杀青（260 ℃）→揉捻（3 min）→烘干（120 ℃）→烘青绿茶样品。委托农业部茶叶质量监督检验测试中心，对样品进行感官审评，发现其中7 个样品具有明显的“清香”香气品质，分析结果如表1所示。

表1 7 个不同茶树品种绿茶的香气感官审评结果Table 1 Sensory evaluation results of green tea samples processed from various tea cultivars

1.1.2 试剂

无水乙醚（分析纯） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；无水硫酸钠（分析纯） 上海试四赫维化工有限公司；正构烷烃（C3～C9，C8～C40）、标准品：癸酸乙酯、正己醛、乙苯、苯甲醛、2-正戊基呋喃 北京百灵威科技有限公司；标准品：芳樟醇、β-大马士酮、(E)-β-紫罗兰酮、(E)-橙花叔醇、雪松醇、二甲基硫醚、β-环柠檬烯 美国Sigma-Aldrich公司。

1.2 仪器与设备

同时蒸馏萃取装置 自制；HH-1数显恒温水浴锅 常州澳华仪器有限公司；TC-15恒温电热套海宁市华星仪器厂；AB104-S电子分析天平 瑞士梅特勒-托利多集团；Pegasus 4D GC×GC-TOFMS仪 美国Leco公司；GC-O仪 德国Gerstel GmbH & Co公司。

1.3 方法

1.3.1 样品的制备

采用同时蒸馏萃取法提取茶样的香气成分。具体步骤如下：称取待测茶叶样品10.00 g，置于500 mL圆底烧瓶中并加入300 mL沸蒸馏水，并加入0.2 μg/mL的癸酸乙酯作为内标，用电热套加热至微沸。将30 mL重蒸无水乙醚加入萃取瓶中，50 ℃水浴蒸馏萃取1 h，并将获得的物质用无水硫酸钠去除水分，氮气浓缩后放入进样瓶内-20 ℃密封保存、待测。

1.3.2 GC×GC-TOFMS分析条件

一维柱色谱柱：DB-5MS（30 m×250 μm，0.25 μm）；二维柱色谱柱：DB-17HT（1.9 m×100 μm，0.10 μm）；进样口温度280 ℃；传输线温度270 ℃；载气：氦气（99.999%）；不分流进样；调制解调时间间隔4.0 s；样品进样量1.0 μL。一维柱升温程序：60 ℃保持3.0 min，以4.0 ℃/min速率升至280 ℃，保持2.5 min；二维柱升温程序：65 ℃保持3.0 min，以4.0 ℃/min速率升至280 ℃，保持2.5 min；总分析时间60.5 min。

MS条件：电子电离源；电离能量-70 eV；质量扫描范围33～600 u；离子源温度220 ℃。

1.3.3 香气成分的定性定量分析

在仪器工作站标准谱库上检索匹配，根据正相似度、反相似度及可能性筛选出可能的化合物，并结合相关文献报道、各香气成分的相对保留时间、保留指数、标准品验证等进行定性；香气成分含量用各待测物含量以其峰面积与内标（癸酸乙酯）峰面积之比表示。

1.3.4 GC-O测定

GC-O条件：升温程序同1.3.1.1节；1∶1分流进样；进样口温度230 ℃；传输线温度260 ℃；载气为高纯氮气（99.99%）。嗅闻分析组由5 名具有丰富审评经验的审评员组成，所有嗅闻人员对GC-O有一定的实验基础，并经过了至少30 h的闻香培训；在实验过程中至少有3 名评价员在同一嗅闻时间处得到相同的感官描述，则将该记录记入最终结果。感官评价员不仅要描述化合物的气味性质，还要确定化合物的气味强度。香气强度用数值“1～4”表示，“1”表示香气强度弱，“2”表示香气强度中等，“3”表示香气强度强，“4”表示香气强度非常强。

1.3.5 OAV分析

在各种挥发性成分定量的基础上，根据参考文献中各挥发性物质在水中的风味阈值，按下式计算各成分的OAV：

式中：Ci为茶叶组分的含量/（ng/g）；OTi为组分i在水中的香气阈值/（μg/kg）。OAV不小于1的化合物被确定为茶叶中的活性香气化合物。

1.4 数据处理

采用ChromaTOF软件系统进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 “清香”绿茶香气成分的同时蒸馏萃取-GC×GCTOFMS分析

图1 “清香”绿茶香气成分的3D色谱图（A）及总离子流图（B）Fig. 1 3D chromatograms (A) and total ion current chromatograms (B)of aroma components in green tea samples with fresh scent flavor

同时蒸馏萃取法具有成本低、操作方便、对微量成分提取效率高的特点，具有良好的重复性和较高的萃取量，便于定量分析[12]。本研究采用同时蒸馏萃取-GC×GC-TOFMS分析方法，对皖农9号、悦茗香、凫早2号、鄂茶1号、毛蟹、淩州2号及龙井43这7 个茶树品种“清香”绿茶的香气成分进行分析。通过Pegasus 4D工作站质谱库的自动检索，在样品的香气成分中共分离出上千个样品峰，如图1所示。

经ChromaTOF软件匹配、质谱鉴定、保留指数测定及标准品验证等多种手段结合，综合筛选后确定出在7 个“清香”绿茶中含有270 个共有香气组分（表2）。根据它们化学结构的差异，可将其分为19 类（表3），分别为烯醇类、烯类、胺类、烷烃类、醛类、烯醛类、醚类、醇类、酯类、内酯类、烯酯类、烯酮类、酮类、酚类、有机酸类、含硫化合物、氮杂环化合物、氧杂环化合物以及芳香烃化合物等。其中，烷烃类化合物的数量最多（37 种），芳香烃化合物次之（33 种），其次为醛类和酮类化合物（均为23 种），酚类化合物最少（只有

表2 GC×GC-TOFMS分析鉴定出的7 个“清香”绿茶中的香气化合物Table 2 List of aroma compounds in 7 green tea samples with fresh scent flavor identi fied by GC ×GC-TOFMS analysis ng/g

续表2 ng/g

续表2 ng/g

续表2 ng/g

续表2 ng/g

续表2 ng/g

表3 “清香”绿茶的挥发性成分组成及其含量Table 3 Volatile composition and contents of green tea sample with fresh scent flavor ng/g

3 种）。此外，在不同种类香气成分的含量上，醛类化合物含量最高（平均为1 028.46 ng/g），醚类化合物和醇类化合物次之（平均分别为877.67 ng/g和711.36 ng/g），其次为烷烃类化合物（667.95 ng/g）、芳香烃化合物（277.56 ng/g）、酯类化合物（224.12 ng/g）；上述6 类化合物的总量占挥发物总量的79.44%。可见，“清香”绿茶挥发性成分组成的一个重要特点是其含有丰富的醛类化合物、醚类化合物、醇类化合物、烷烃类化合物、芳香烃化合物以及酯类化合物等。此外，该批“清香”绿茶挥发性成分中，含量较高的成分（≥100 ng/g）主要有芳樟醇、香叶醇、叶绿醇、乙醛、吲哚、乙苯、2-乙氧基丁烷、乙丙醚等（表2）。研究表明，在食品中鉴定出的众多挥发性化合物中，绝大部分的挥发性组分并不是香气呈现中有效贡献的成分，仅有很少一部分化合物赋予食品特殊的香气属性，并在特征香气的呈现中起到主要贡献作用，具有这样性质的挥发性组分称为关键香气组分或活性香气组分[13]。因此，挥发性成分含量的高低并不能说明对风味的贡献度大小，绿茶“清香”的关键香气成分还需要结合GC-O-MS结果与OAV分析做进一步判断。

2.2 “清香”绿茶中香气成分的OAV分析

表4 “清香”绿茶中OAV分析确定的关键嗅感化合物的OAV及香气特征Table 4 Key aroma compounds in green tea sample with fresh scent flavor identified by OAV

续表4

香气化合物单体在整体香气中的贡献主要取决于阈值及其含量，可以通过计算OAV进行表征。随着食品风味学的发展，通过现代分析技术、食品加工技术和感官分析技术紧密结合，OAV相关技术在食品关键香气成分表征和食品调香中的推广应用将愈加广泛[14]。通过OAV计算，从本研究鉴定出的众多挥发性成分中筛选出20 个OAV不小于1（7 个样品的平均值）的关键香气成分（表4），说明这些成分可能对绿茶的“清香”香气品质具有重要贡献；其中，包含9 个醛类化合物、4 个醇类化合物、3 个碳氢化合物、2 个酮类化合物、1 个酯类化合物和1 个杂氧化合物。

在20 个香气活性物质中，OAV不小于200的物质有3 种，其中具有紫罗兰香气的(E)-β-紫罗兰酮由于其极低的阈值（0.007 μg/kg）在所有化合物中的OAV最高（1 243.36）；其次为具有刺激辛辣味的1-甲基萘（278.14）和具有强烈玫瑰香的β-大马士酮（204.27）；推断这3 个物质对绿茶“清香”香气品质具有关键性贡献作用；此外，10≤OAV≤100的物质有9 种，分别为3-甲基丁醛（86.18）、壬醛（83.67）、乙醛（64.46）、癸醛（39.60）、萘（25.55）、雪松醇（18.37）、芳樟醇（16.92）、香叶醇（14.92）和苯乙醛（13.39）；OAV小于10的物质有8 种，分别为正辛醛（9.90）、苯甲醛（8.88）、正己醛（6.51）、(E)-2-壬烯醛（4.82）、(Z)-己酸-3-己烯酯（4.75）、乙苯（3.82）、(E)-橙花叔醇（2.59）和2-正戊基呋喃（1.57）。这些化合物可能共同决定了绿茶“清香”的香气品质特征。

(E)-β-紫罗兰酮带有特征性的紫罗兰花香气，韩卓潇[15]采用OAV法检测发现以其为代表的一些花香化合物为茶树新品种白桑茶的关键呈香成分；β-大马士酮具有浓郁强烈的玫瑰香，且气味阈值较低，曾亮等[16]认为以其为代表的一些化合物为工夫红茶的主要呈香物质；芳香烃类化合物如萘、1-甲基萘表现为特殊的焦油、樟脑以及刺激辛辣、陈腐等气味特征，被认为是青砖茶的关键香气成分[17]。研究表明，具有青草类气味的化合物如正己醛、苯乙醛和癸醛，为清香型铁观音的清香味主要来源[18]；壬醛除了带有花香特征外，还具有蜡烛、甜橙及油脂的气味，大多作为柑橘类香精油的组成成分被检测到[19]；此外，有报道指出，癸醛和(Z)-3-己烯醇增强了蒸青绿茶的清香[20]。芳樟醇为茶中普遍存在的重要的呈香成分，具有R-型芳樟醇和S-型芳樟醇2 种旋光异构体，前者具有甜香、花香和类似橙叶的香气，而后者带有类似木香和薰衣草的香气特征[21]。(E)-橙花叔醇略带橙花、玫瑰气味、甜味，是福建乌龙茶品种最主要的香气成分[22]；雪松醇为带有雪松木气味的萜烯类物质，对龙井茶香气具有重要贡献[23]；香叶醇带有浓郁玫瑰香、蔷薇香，被认为是祁门红茶的特征香气成分[24]。绿茶中常见的顺-己酸-3-己烯酯呈现强烈弥散性梨香，是绿茶清香的重要关联成分[25]，对西湖龙井茶香气的形成具有显著贡献[26]；2-正戊基呋喃带有豆类、水果、青味及蔬菜等的气味，多生成于美拉德反应[27]；乙苯同样带有芳香气味，并在祁门红茶[28]等多种茶类中均有检出。

2.3 “清香”绿茶中关键嗅感物质的GC-O-MS分析

将7 个绿茶样品按相同比例混合均匀后进行GCO-MS分析，发现可嗅闻到28 种香气化合物，如表5所示。在所嗅闻出的28 个化合物中，包含12 个碳氢化合物、5 个酯类化合物、4 个酮类化合物、2 个醛类化合物、1 个醇类化合物、1 个杂氧化合物、1 个含硫化合物和2 个未知化合物。此外，二甲基硫醚（3.0）、松油烯（3.0）、芳樟醇（2.6）、萘（2.6）、(Z)-己酸-3-己烯酯（2.6）、(E)-β-紫罗兰酮（2.5）、2-正戊基呋喃（2.4）、(E,E)-3,5-辛二烯-2-酮（2.4）和(Z)-2-甲基丁酸-顺-3己烯酯（2.4）等化合物的香气强度较高，这些化合物的香气特征普遍为草本清香或花香等，推断它们是决定绿茶“清香”特性的一些关键香气化合物。

表5 “清香”绿茶中GC-O-MS确定的香气活性物质的香气特征及强度Table 5 Key aroma compounds in green tea sample with fresh scent flavor identi fied by GC-O-MS

续表5

上述化合物中，二甲基硫醚曾被鉴定为西湖龙井茶具有“新茶香”的关键香气物质，是由茶叶炒制过程中甲基蛋氨酸锍盐受热分解产生的，可与残留的青叶醇共存形成绿茶的“新茶香”，这种特殊的茶香会随着茶叶贮藏期的延长而挥发散失，使绿茶丧失了新茶的香味[29]；茶螺烷具有典型的红茶香气、果香，主要存在于桂花精油、野樱桃、红茶中[30]；荜澄茄油烯具有蜡烛气味，在蒸青绿茶中具有较高含量[31]；2,4-二甲基庚烷嗅闻具有不愉悦的硫磺味，庚醛嗅闻表现出烘烤咖啡气味。

2.4 “清香”绿茶关键香气物质分析鉴定中OAV和GCO-MS方法的比较

结合表4、5可知，OAV法和GC-O-MS法2 种方法共同检测到7 种物质，包括芳樟醇、壬醛、(E)-β-紫罗兰酮、(Z)-己酸-3-己烯酯、乙苯、萘和2-正戊基呋喃等，说明这些物质对绿茶的“清香”香气品质具有极其重要的贡献。此外，采用这2 种方法鉴定出的化合物也有很大的差异，究其原因，可能主要在于GC-O法与OAV方法各有其优缺点：前者由于实验中存在嗅觉疲劳等原因，评价结果存在一定的主观性与不稳定性，评价结果易受评价员个人因素影响[32]；而后者与前者相比，虽然分析结果相对客观，但该方法中阈值的测定方式与结果一直存在较大争议。研究发现，实际香气组分之间在整体香气贡献中具有协同或拮抗效应[33]。某些OAV小于1的物质因与其他物质间存在协同效应而使其香气被人们感知；某些OAV大于1的物质可能由于与其他物质之间的拮抗作用而使其香气属性不被人们觉察[32]。例如，Zhu Jiancai等[34]在有关乌龙茶中挥发性化合物协同作用研究中发现，具有相似物质结构或气味特征化合物之间，会产生协同及相加效应，从而导致某种气味强度的增加；而结构不同化合物之间则可能产生掩蔽效应，从而导致某类气味强度的降低甚至消失。此外，消减实验表明一些亚阈值化合物同样也会对乌龙茶的整体呈香产生影响。由此推测，具有“清香”气味特征的(Z)-己酸-3-己烯酯、2-正戊基呋喃之间可能表现为协同或加成作用，呈现“芳香”气味特征的芳樟醇、壬醛、(E)-β-紫罗兰酮、乙苯之间可能表现为协同或加成作用，但具体这些香气成分如何构建了绿茶的“清香”品质，其中又有何种香气成分的香气被掩盖、抑制，则还需要进一步综合香气成分浓度、结构以及嗅觉神经受体神经元的响应特性等手段进一步分析[35-36]。可见，OAV方法对样品中的特征风味化合物的分析也存在一定局限性，需将OAV与GC-O方法结合起来确定样品的特征风味组分[37]。此外，香气化合物重组与消减实验是将不同香气化合物添加到一定介质中，利用人的嗅觉判断特定香气化合物对物质整体呈香贡献，该方法已成为国际上应用普遍的关键呈香成分验证方法。本研究后续还需要进一步开展验证分析等，也需要采集大量“清香”显著的茶叶成品进行分析检测，并与本研究结果进行对比分析。

3 结 论

本研究采用同时蒸馏萃取-GC×GC-TOFMS技术分析“清香”绿茶的香气成分，在7 个代表性茶叶样品中鉴定出19 类物质共计270 种共有香气化合物；研究表明，“清香”绿茶挥发性成分中含有丰富的醛类、醚类、醇类、烷烃类、芳香烃化合物以及酯类等化合物，其中芳樟醇、香叶醇、叶绿醇、乙醛、吲哚、乙苯、2-乙氧基丁烷和乙丙醚等是含量较高的香气成分。

OAV法分析了“清香”绿茶中20 个OAV不小于1的关键香气成分，其中OAV较大的化合物包括(E)-β-紫罗兰酮、1-甲基萘、β-大马士酮、3-甲基丁醛、壬醛、乙醛、癸醛、萘、雪松醇、芳樟醇、香叶醇和苯乙醛等；GCO-MS分析了“清香”绿茶中28 种香气化合物，其中，二甲基硫醚、松油烯、芳樟醇、萘、(Z)-己酸-3-己烯酯、(E)-β-紫罗兰酮、2-正戊基呋喃、(E,E)-3,5-辛二烯-2-酮、2-甲基丁酸-顺-3己烯酯等化合物的香气强度较高。

OAV法和GC-O-MS法2 种方法共同检测到“清香”绿茶中7 种物质，包括芳樟醇、壬醛、(E)-β-紫罗兰酮、(Z)-己酸-3-己烯酯、乙苯、萘和2-正戊基呋喃等，表明这些物质对绿茶的“清香”香气品质具有极其重要贡献，它们是绿茶“清香”特性的关键香气化合物，共同构成了绿茶“清香”香气品质特征。研究结果可为绿茶“清香”香气品质的科学评价和研究绿茶香型定向加工技术等提供重要科学依据。