传统奶酪中产转糖基活性β-半乳糖苷酶乳酸菌的筛选鉴定及其合成低聚半乳糖条件

王丽军，牟元珍，关 波*，万丽云，张 艳，胡有贞，倪永清

（石河子大学食品学院，新疆 石河子 832003）

低聚半乳糖（galacto-oligosaccharides，GOS）是一类与人乳寡糖（human milk oligosaccharides，HMOS）结构近似，由数量不等的半乳糖单元，以葡萄糖或半乳糖单元为还原性末端，通过β-(1,4)、β-(1,6)、β-(1,3)等β-糖苷键构成的异质性低聚糖[1]。作为一类益生特性显著的低聚糖，GOS无法被人类肠道消化吸收，能够选择性促进乳杆菌（Lactobacillussp.）和双歧杆菌（Bifidobacteriumsp.）等益生菌的生长[2]，从而改善肠道对矿物质的吸收、抑制病原菌并发挥调节机体免疫系统的作用[1,3-4]。GOS还具有良好的热稳定性和耐酸性，加工性能良好，非常适合作为多种配方食品及饮料的膳食添加剂。20世纪90年代以来，GOS作为膳食补充剂先后在日本和欧洲上市。到2007年，全球GOS的产量已达25 000 t，市值超过1.3亿 美元[5]。此外，生产GOS的原料乳清来源丰富且成本低，同时缓解了乳清带来的环境污染问题。因此，在目前HMOS来源有限且合成困难的背景下[6-7]，以GOS为代表的低聚糖在新生儿和婴儿配方乳品中具有良好的应用前景，国内外市场潜力巨大[8]。

由于GOS具有富含羟基结构的半乳糖单元及葡萄糖单元，且单糖单元间可以由不同糖苷键连接，化学结构的复杂性使得作为膳食补充剂的GOS难以通过化学方法合成，因此，GOS的商业化生产主要以乳清中的乳糖为原料，通过微生物酶法催化合成。β-半乳糖苷酶（EC 3.2.1.23），又称乳糖酶，常用于乳糖水解，可生成半乳糖和葡萄糖，某些微生物来源的β-半乳糖苷酶在水解乳糖分子的同时，还具有转半乳糖基的活性，能够以乳糖或葡萄糖分子作为半乳糖基受体合成GOS[1,3,9-11]。目前合成GOS的商业化β-半乳糖苷酶制剂主要来源于米曲霉（Aspergillus oryzae）、乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）和环状芽孢杆菌（Bacillus circulans）。目前3 种主要商业化菌株来源的β-半乳糖苷酶合成GOS的最适pH值和反应温度存在明显差异，GOS得率仅在30%左右，有些β-半乳糖苷酶对乳糖的水解活性显著强于转糖基活性，且合成GOS的键型主要以β-(1,4)糖苷键为主，产品的益生指数偏低[5]，因此，迫切需要筛选更适合GOS合成的β-半乳糖苷酶新酶源。

双歧杆菌、乳杆菌等乳酸菌具有一般公认安全（generally regarded as safe，GRAS）的优势，使得其所生产的β-半乳糖苷酶可不经精细纯化即可应用于GOS合成。有研究发现来源于双歧杆菌、乳杆菌菌株的β-半乳糖苷酶偏好合成β-(1,6)和β-(1,3)糖苷键型的GOS[12]，对肠道细菌的生长及代谢活性有更好的选择性[13-15]，因此双歧杆菌、乳杆菌等乳酸菌来源的β-半乳糖苷酶更适合高益生指数GOS的合成。

基于以上研究背景，本研究从新疆伊犁地区少数民族传统奶酪样品中分离筛选产转糖基活性β-半乳糖苷酶的乳酸菌菌株，进一步对筛选菌株产β-半乳糖苷酶培养条件、以乳糖为底物合成GOS的反应条件及产物成分进行研究，以期为高益生指数GOS的合成提供新的食品级产酶菌株。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

奶酪样品取自新疆伊犁地区牧民家中，为半干型奶酪。样品置于无菌样品袋中低温运回实验室，4 ℃条件下保存备用。

MRS种子培养基：琼脂粉20 g/L、蛋白胨10 g/L、牛肉浸粉10 g/L、酵母浸粉5 g/L、葡萄糖20 g/L、K2HPO45 g/L、柠檬酸铵2 g/L、乙酸钠5 g/L、MgSO4·7H2O 0.58 g/L，吐温-80 1 mL/L，MnSO40.25 g/L，pH 6.3，121 ℃灭菌20 min。

发酵培养基：K2HPO42 g/L、醋酸钠5 g/L、柠檬酸二铵2 g/L、MgSO4·7H2O 2 g/L、MnSO4·4H2O 0.05g/L，吐温-80 1 mL/L，pH 6.3（其他成分在优化培养时注明），121 ℃灭菌20 min。

5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖（X-Gal）、异丙基硫代半乳糖苷（isopropyl-D-thiogalactopyranosid，IPTG）、邻硝基苯-β-D-半乳糖苷（o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside，ONPG） 生工生物工程（上海）股份有限公司；所用生化溶剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

Silica gel 60 No.553薄层色谱（thin layer chromatography，TLC）板 德国Merck公司；104G-102型梯度热循环聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增仪德国SensoQuest公司；X7酶标仪 美国BioTek有限公司；LC-10A高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）（RID-10A视差检测器） 岛津（上海）实验器材有限公司；Hi-Plex Na Column糖分析柱（300 mm×7.7 mm） 安捷伦科技（中国）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品处理及菌株的分离及初筛

取保存的奶酪样品适量，在超净工作台内取出，置于已灭菌的50 mL离心管中，以灭菌生理盐水充分振荡分散后，无菌生理盐水梯度稀释（10-3、10-4、10-5），每个稀释度吸取100 μL悬液均匀涂布到添加有X-Gal和IPTG的MRS培养基平板上，37 ℃恒温培养12～16 h，以菌落的蓝白色作为初筛依据，挑选蓝色菌落分离纯化3 次。

1.3.2 粗酶液提取及β-半乳糖苷酶活力测定

细胞的破碎及粗酶液提取参考Zhang Hongzhi等[16]的方法，稍有修改。蓝色单菌落于MRS液体培养基中培养12 h，8 000×g冷冻离心10 min收集细胞，用等体积50 mmol/L磷酸缓冲液（pH 6.5）洗涤3 次，用上述缓冲液配制的1 mg/mL溶菌酶缓冲液37 ℃孵育处理2 h，冰浴条件下超声破碎（工作3 s停8 s、功率125 W、时间15 min），8 000×g冷冻离心10 min，取上清液即为粗酶液。取50 μL粗酶液与50 μL 50 mmol/L磷酸缓冲液（pH 6.5）配制的ONPG溶液，于一定温度下反应10 min，反应结束后加入200 μL 0.5 mol/L的碳酸钠溶液终止反应，静置5 min后，肉眼可见显黄色，于420 nm波长处测定吸光度，计算酶活大小。酶活单位定义为：在一定的条件下，1 min水解ONPG生成1 μmol邻硝基苯酚的酶量为1 个酶活单位（U）。

1.3.3 菌株的形态学观察和生理生化实验

目的菌株接种于营养琼脂培养基37 ℃培养24 h，观察菌落形状、色泽、透明度、致密度等培养特征。挑取一环菌体涂于载玻片进行革兰氏染色，镜检。通过过氧化氢酶实验、糖发酵实验、淀粉水解实验、明胶液化实验和硫化氢实验测定其生理生化特性，参照文献[17]中相关描述进行鉴定。

1.3.4 16S rRNA基因的克隆及其序列分析

提取基因组DNA进行16S rRNA基因扩增，扩增产物使用试剂盒进行纯化回收，纯化的目的产物与pMD19-T Cloning Vector进行连接，从转化成功的平板培养基上任意挑取白斑单菌落于LB液体培养基中，37 ℃培养箱中过夜培养，吸取1 μL菌液扩增菌液PCR，菌液PCR产物用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，进而得到阳性克隆。提取得到的质粒使用M13 Forward Primer、M13 Reverse Primer引物进行序列分析。将测序结果提交于GenBank数据库，BLAST进行在线序列同源性分析，从数据库获得相关种属的16S rRNA序列，建立系统发育树，进化距离的计算采用Neighbor-Joining法，在MEGA 6.0软件中用p-distances和Kimura-2 parameter双参数法进行系统发育树的构建，选用Bootstrap法评价进化树分支聚类的稳定性，重复1 000 次，初步确定产酶菌株的种属分类地位。

1.3.5 菌株产酶条件优化

1.3.5.1 碳源

在发酵培养基中分别加入不同的碳源组合：20 mg/mL葡萄糖、20 mg/mL乳糖、20 mg/mL蔗糖、20 mg/mL半乳糖、10 mg/mL葡萄糖＋10 mg/mL半乳糖及10 mg/mL葡萄糖＋10 mg/mL乳糖，37 ℃摇床培养12 h，分别测定发酵液中的酶活。

1.3.5.2 乳糖质量浓度

在发酵培养基中分别加入不同质量浓度的乳糖（5、10、20、30 mg/mL），37 ℃摇床培养12 h，分别测定发酵液中的酶活。

1.3.6 生长曲线和产酶曲线的测定

将菌种接种到5 mL优化过的发酵培养基中，30 ℃过夜培养后，以2 %接种量转接到新鲜的10 mL MRS培养基中，30 ℃培养，每间隔4 h取样，测定菌体浓度（OD600nm）和发酵液中的β-半乳糖苷酶酶活。

1.3.7 β-半乳糖苷酶转糖基活性的测定及反应条件的优化

取超声破碎获得的粗酶液50 μL（50 mg湿菌体），与300 μL 300 mg/mL的乳糖溶液反应，50 ℃反应12 h，于100 ℃处理10 min终止反应，反应液以无水乙醇稀释至糖质量浓度10 mg/mL，然后TLC分析反应产物测定β-半乳糖苷酶的转糖基活性。

转糖基反应条件的优化，取超声破碎获得的粗酶液50 μL（50 mg湿菌体），与300 μL乳糖溶液反应，分别在不同pH值（以pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的磷酸氢二钠-柠檬酸钠缓冲液配制乳糖溶液）、初始乳糖质量浓度（以pH 6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸钠缓冲液配制100、200、300、400 mg/mL的乳糖溶液）、反应温度（45、50、55、60 ℃）及反应时间（2、4、6、12、24 h）的条件下进行酶催化转糖基反应，TLC分析转糖基产物，确定酶催化反应的最佳条件。

1.3.8 TLC分析

参考卢丽丽等的方法[18]。取活化过的硅胶铝板一块，毛细管点样后以正丁醇-乙醇-水（5∶3∶2，V/V）为展层剂上行展层，层析至距离顶端1 cm处，取出用吹风机吹干，然后以显色剂（苯胺-二苯胺-磷酸）喷雾，于120 ℃烘箱中烘10 min，各种糖即显出不同颜色的斑点，将薄板扫描后，通过软件ImageJ 1.40对样品中转糖基反应产物的斑点进行定量分析。1.3.9 HPLC分析

参考卢丽丽等的方法[18]。转糖基产物以三蒸水稀释为50 mg/mL的糖溶液，0.22 μm滤膜过滤后HPLC进样分析。色谱柱为Hi-Plex Na低聚糖分析柱，流动相为三蒸水，流速0.3 mL/min，柱温80 ℃，进样量20 µL。

1.4 数据处理

酶活测定数据为3 次平行测定结果；TLC分析采用软件ImageJ 1.40对糖斑点进行扫描定量，确定糖组分的含量；HPLC分析采用岛津LabSolutions色谱数据处理系统进行峰面积积分，确定糖组分的含量，所有数据统计采用Excel软件，图表采用Origin Pro 8软件绘制。

2 结果与分析

2.1 产转糖基活性β-半乳糖苷酶菌株的筛选鉴定

2.1.1 转糖基活性β-半乳糖苷酶产生菌的筛选

分离纯化得到的可培养物在含有X-gal的MRS平板上划线分离，得到32 株菌落为蓝色的菌株，表明这32 株菌具有β-半乳糖苷酶活性。收集初筛菌株的菌体细胞，破碎得到粗酶液，以乳糖为底物进行转糖基反应进行复筛，产物采用TLC分析，结果如图1所示，获得具有转糖基活性的菌株6 株，其中菌株YLBGNL-S7的转糖基活性最强，因此对该菌株开展进一步的研究。

图1 TLC分析复筛菌株的转糖基反应产物Fig. 1 TLC analysis of the transglycosylation reaction products produced by selected strains

2.1.2 形态学及生理生化特征

形态学观察显示，菌株YLBGNL-S7在MRS培养基上形成圆形菌落，边缘整齐，表面光滑，呈乳白色；菌体杆状，革兰氏染色阳性。

菌株YLBGNL-S7的生理生化特征见表1，该菌株能发酵葡萄糖、乳糖，不能发酵阿拉伯糖、鼠李糖、木糖，且淀粉水解实验、明胶水解实验、硫化氢产生实验结果均为阴性。这些特征与乳酸杆菌的特征极为相似，初步断定该株菌为乳杆菌。

表1 菌株YLBGNL-S7的生理生化特性Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain YLBGNL-S7

2.1.3 16S rRNA基因的克隆及其序列分析

对菌株YLBGNL-S7的16S rRNA基因序列进行扩增，获得大小约为1 500 bp的扩增片段（GenBank登录号为MH917109）。将扩增所得基因序列与GenBank数据库中的序列进行同源性比对，比对结果显示，菌株YLBGNL-S7的16S rRNA基因序列与多株L. plantarum的16S rRNA基因序列相似性均达到99%。系统进化分析（图2）显示YLBGNL-S7与L. plantarumJCM 13899（LC311069.1）、L. plantarumDJ-04（KF929420.1）、L. plantarumA16（MG754631.1）及L. plantarumNi344（AB601168.1）等菌株以100%的支持率聚成一簇。结合生理生化实验，将菌株YLBGNL-S7鉴定为L. plantarumYLBGNL-S7。

图2 菌株YLBGNL-S7的系统进化分析Fig. 2 Phylogenetic tree of strain YLBGNL-S7

2.2 产β-半乳糖苷酶条件的优化

2.2.1 碳源对产酶的影响

为确定L. plantarumYLBGNL-S7产酶的最佳碳源，分别以不同的碳源组合的发酵培养基，37 ℃摇床培养12 h，测定菌株的生物量OD600nm及产β-半乳糖苷酶酶活，结果如图3所示，不同碳源条件下菌株的生物量无明显差异，但以乳糖为单一碳源时YLBGNL-S7菌株产β-半乳糖苷酶的酶活最高，可达（84.5±2.9）U/mL，显著高于其他碳源（组合），表明该菌株所产β-半乳糖苷酶为诱导酶。

图3 碳源对产β-半乳糖苷酶的影响Fig. 3 Effect of carbon source on the production of β-galactosidases

2.2.2 乳糖质量浓度对产酶的影响

进一步对不同乳糖质量浓度条件下YLBGNL-S7菌株产β-半乳糖苷酶的水平进行测定，结果表明（图4），乳糖质量浓度为10 mg/mL时，最适合该菌株发酵产β-半乳糖苷酶。

图4 乳糖质量浓度对产β-半乳糖苷酶的影响Fig. 4 Effect of lactose concentration on the production of β-galactosidases

2.2.3 菌株的产酶曲线与生长曲线

在以上单因素试验优化的基础上，将L. plantarum YLBGNL-S7菌株接种于改良的MRS培养基中，37 ℃摇床培养至24 h，产酶曲线显示该菌株在培养18 h左右时产酶水平最高，可达（157.1±7.9） U/mL（图5）。

图5 YLBGNL-S7菌株产β-半乳糖苷酶曲线及生长曲线Fig. 5 β-Galactosidase production curve and growth curve of strain YLBGNL-S7

2.3 β-半乳糖苷酶转糖基反应条件的研究

2.3.1 pH值对GOS合成的影响

分别以pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的磷酸氢二钠-柠檬酸钠缓冲液配制乳糖溶液，55 ℃进行转糖基反应，TLC分析不同反应pH值条件的产物（图6）。结果表明，pH 6.0为转糖基反应的最适pH值。

图6 TLC分析pH值对GOS合成的影响Fig. 6 Effect of pH on GOS synthesis

2.3.2 初始乳糖质量浓度对GOS合成的影响

随着初始乳糖质量浓度的增加，转糖基反应产物中GOS的量逐渐增加（图7），当初始乳糖质量浓度为300 mg/mL时，转糖基反应生成GOS的得率最高。

图7 TLC分析初始乳糖质量浓度对GOS合成的影响Fig. 7 Effect of initial lactose concentration on GOS synthesis

2.3.3 反应温度对GOS合成的影响

用pH 6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸钠缓冲液配制300 mg/mL的乳糖溶液，分别在45、50、55、60 ℃进行转糖基反应，TLC分析其产物。结果显示（图8）转糖基反应的最适温度为50 ℃。

图8 TLC分析反应温度对GOS合成的影响Fig. 8 Effect of reaction temperature on GOS synthesis

2.3.4 反应时间对GOS合成的影响

随着反应的进行，反应液中乳糖含量不断降低，反应4 h转糖基反应生成的GOS含量最高，继续反应，转糖基反应产物中的GOS含量逐渐降低（图9），因此确定该β-半乳糖苷酶以乳糖为底物合成GOS的最佳反应时间为4 h。

图9 TLC分析反应时间对GOS合成的影响Fig. 9 Effect of reaction time on GOS synthesis

2.4 以乳糖为底物合成GOS产物组分的定量分析

基于TLC分析的实验结果，取pH 6.0，初始乳糖质量浓度为300 mg/mL，50 ℃条件下转糖基反应4 h的GOS产物进行HPLC分析，结果见图10。其中保留时间为34.375 min的峰为半乳糖，保留时间为32.022 min为葡萄糖，26.740 min为二糖（乳糖和转移二糖未分离），22.522 min为低聚半乳三糖，6.758～19.485 min之间的峰为三糖以上的低聚半乳糖成分。

根据峰面积计算，最适反应条件下转糖基产物中葡萄糖质量分数为29.84%，半乳糖质量分数为15.28%，二糖（包括乳糖和转移二糖）质量分数为29.77%，转移三糖质量分数为12.95%，转移三糖以上的GOS质量分数为12.17%。结合TLC分析中乳糖与转移二糖斑点的扫描结果，确定乳糖质量分数为11.48%，转移二糖质量分数为18.29%。因此，可确定以L. plantarum YLBGNL-S7所产β-半乳糖苷酶催化乳糖合成GOS的得率为43.40%，GOS成分以转移二糖和转移三糖为主，分别为18.29%和12.95%，残余乳糖质量分数仅为11.48%。

图10 转糖基反应产物的HPLC分析Fig. 10 HPLC analysis of transglycosylation reaction productions

3 讨 论

β-半乳糖苷酶以乳糖为底物既能分解生成半乳糖和葡萄糖，也能在一定条件下通过转半乳糖基反应合成GOS。以乳糖为底物反应合成GOS的得率主要取决于β-半乳糖苷酶本身的特性及乳糖质量浓度、水活度、温度、pH值等反应条件[5,19]。不同来源的β-半乳糖苷酶其乳糖水解活性与转糖基活性相对比例差异较大[20]。近期分离的产转糖基活性较高的β-半乳糖苷酶菌株主要有成团肠杆菌[18]、枯草芽孢杆菌[21]、嗜热脂肪地芽孢杆菌[22]、巴伦葛兹类芽孢杆菌[23]、马克思克鲁维酵母[24-25]、曲霉[26]、青霉[27]以及部分古生菌[28-29]。

与A. oryzae等菌株可分泌表达β-半乳糖苷酶不同，乳酸菌来源的β-半乳糖苷酶通常为胞内酶。但乳酸菌作为GRAS的微生物类群，赋予其生产的酶在食品加工中不经特别纯化即可应用的优势。因此，本研究选择新疆伊犁地区少数民族传统奶酪样品进行分离筛选，并成功获得产转糖基活性较高的β-半乳糖苷酶乳酸菌6 株。对其中转糖基活性最高的YLBGNL-S7菌株进行生理生化和16S rRNA基因序列比对分析，确定该菌株为植物乳杆菌（L. plantarum）。近年来，除两歧双歧杆菌[13]和植物乳杆菌[30-31]外，国内外研究者还相继从罗伊氏乳杆菌[14]、戊糖乳杆菌[32]、米酒乳杆菌[33]、马乳酒样乳杆菌[34]、嗜热链球菌[35]等乳酸菌菌株中分离获得具有转糖基活性的β-半乳糖苷酶。

此外，已有来源于人唾液L. plantarum WCFS1及来源于传统泡菜L. plantarum 70810的β-半乳糖苷酶合成GOS的报道[16,30]，但来源于奶酪的乳源L. plantarum β-半乳糖苷酶合成GOS的研究鲜见报道。对比不同来源L. plantarum产β-半乳糖苷酶水平可以发现，本研究分离筛选的乳源L. plantarum YLBGNL-S7和泡菜来源L. plantarum 70810在乳糖为碳源的MRS培养基中产β-半乳糖苷酶水平相差约30 倍（（157.1±7.9）U/mL和5～6 U/mL），表明乳源L. plantarum产β-半乳糖苷酶及分解利用乳糖能力显著强于泡菜来源L. plantarum。基于乳杆菌属菌株基因组学的研究也证明，不同环境来源的相同种属乳杆菌的代谢特点与其生活环境密切相关，特别是一些碳水化合物代谢相关酶的基因在乳杆菌属不同种菌株之间会存在较大的差异[36]。

研究表明，A. oryzae来源β-半乳糖苷酶的最适转糖基反应pH 4.5，B. circulans的最适pH 6.0，而K. lactis的最适pH 7.0[1]。本研究中L. plantarum YLBGNL-S7所产β-半乳糖苷酶以乳糖为底物合成GOS的最适pH 6.0，表明其较为适合于牛乳和乳清中乳糖的水解。YLBGNL-S7所产β-半乳糖苷酶在初始乳糖质量浓度为100～400 mg/mL及45～60 ℃的温度范围内均可有效合成GOS，表明该β-半乳糖苷酶能够在较宽的乳糖质量浓度及温度范围内催化合成GOS。

本研究中从奶酪样品中筛选的L. plantarum YLBGNL-S7所产β-半乳糖苷酶在初始乳糖质量浓度为300 mg/mL、pH 6.0、50 ℃的条件下反应4 h，GOS的得率最高达到43.40%，高于人唾液来源L. plantarum WCFS1的41%[30]，略低于泡菜来源L. plantarum 70810的44.3%[16]，但高于商业化菌株B. circulans来源的β-半乳糖苷酶合成GOS的得率40%[5]。与K. lactis来源β-半乳糖苷酶以乳糖为底物的转糖基反应产物主要为转移二糖不同[19]，YLBGNL-S7合成GOS产物中转移二糖和转移三糖质量分数分别为18.29%和12.95%，残余乳糖质量分数仅为11.48%，与L. plantarum WCFS1来源β-半乳糖苷酶合成GOS中转移二糖质量分数为19%、转移三糖质量分数为21%、转移四糖质量分数1.3%，残余乳糖质量分数为15%较为接近[30]。然而，不同来源L. plantarum所产β-半乳糖苷酶合成GOS的糖苷键类型是否存偏好性的差异，还有待进一步研究。

4 结 论

本研究从新疆伊犁地区少数民族传统奶酪中筛选获得的一株产转糖基活性β-半乳糖苷酶的新菌株，形态学、生理生化及分子生物学鉴定为L. plantarum YLBGNL-S7。该菌株在以乳糖为碳源的MRS培养基中发酵产β-半乳糖苷酶水平可达（157.1±7.9）U/mL，其所产β-半乳糖苷酶在50 ℃、pH 6.0、乳糖质量浓度300 mg/mL反应4 h，反应产物GOS得率可达43.40%，该菌株为酶法合成GOS提供了新的食品级酶源。