NOD1rs7789045基因多态性与广西汉族人群原发性抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎的关系

李雪 薛超 黎伟 黄莉 曹越琦 何佩耕

广西医科大学第二附属医院肾内科（南宁530007）

原发性抗中性粒细胞胞浆抗体（anti-neutrophil cytoplasmic antibodies，ANCA）相关性血管炎（ANCA associated vasculitis，AAV）是一组以小血管炎症和坏死为主要特征的多系统自身免疫性疾病，主要包括显微镜下多血管炎，肉芽肿性多血管炎和嗜酸性粒细胞GPA 等［1］。作为一种多系统自身免疫疾病，AAV 进展迅速，在肺和肾受累中很常见。各种AAV 亚型具有截然不同的地理和种族分布，这表明AAV 发病机制中存在多种复杂因素［2］。ANCA 自身免疫反应的起源是一个多因素的过程，目前原因尚不能明确，主要认为与环境佐剂因子、自身免疫调节以及遗传倾向等有着密切的关系。遗传因素在AAV 发病机制中的重要作用是通过种族差异、家庭聚集和遗传研究发现的［3］。研究表明AAV 的基因单核苷酸多态性（SNPs）对疾病具有一定的遗传易感性［4-6］。目前已有报道显示NOD1 基因多态性与自身免疫性疾病的发病密切相关，如克罗恩病［7］，格林-巴利综合征［8］，特应性湿疹［9］等。NOD1参与多种疾病的发生发展，深入认识其在疾病中的作用机制，对于探索更新的研究思路和更有效的治疗方法有所帮助，分析AAV 的遗传易感性对AAV 的诊断、治疗及其预后具有重要意义。目前NOD1 基因多态性在中国内地人群中的分布及与AAV 患者的关系仍缺乏研究。本研究旨在探讨NOD1 rs7789045 基因多态性与AAV 发病的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集2005年1月至2018年12月在广西医科大学第二附属医院中确诊的79 例广西汉族AAV（病例组）患者，直系亲属三代均为汉族人，其中男35 例，女44 例，诊断标准均参照2012年CHCC 国际血管炎命名会议的标准，并排除AAV 之外的继发性血管炎。对照组为112 例在年龄、性别等与病例组相匹配的广西汉族健康人群，其中 男45 例，女67 例，年龄18～82 岁。所有患者和健康体检者均通过伦理委员会批准并获得其知情同意。

1.2 方法

1.2.1 数据收集收集79 例在广西医科大学第二附属医院中确诊AAV 患者的临床资料、实验室资料。其中临床资料包括姓名、性别、年龄及发热、皮疹、关节痛、水肿、蛋白尿等伴随症状，实验室检验资料包括血白细胞（WBC）、血红蛋白（Hb）、血尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）、血浆白蛋白（Alb）等相关指标。

1.2.2 基因组DNA 提取抽取待检测者2 mL EDTA 抗凝外周血，采用DNA 提取试剂盒（来自北京天根生化科技有限公司），严格按照说明书方法提取。

1.2.3 NOD1 rs7789045A/T 基因型分析采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应（PCR-RFLP）技术。上游引物（F）：5′-AAAGAAGACTCCTGCCCCAG-3′、下游引物（R）：5′-GACCCTACACTGTGCTGGAT-3′（引物由上海生工生物工程有限公司所合成）。PCR 反应总体系20 μL，反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35 个循环，随后72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。限制性内切酶PvuII（美国Thermo Fisher scientific公司）消化以上PCR 扩增目的片段，反应体系为PCR DNA 5 μL，ddH2O 9 μL，PvuII 0.5 μL，buffer 2 μL。在37 ℃恒温下水浴30 min，酶切产物以2%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统下观察NOD1 rs7789045 A/T 基因型

1.2.4 基因型测序分别选取NOD1 rs7789045 的AA（野生型）、AT（杂合突变型）、TT（纯合突变型）3 种基因型多例送上海生工生物工程有限公司测序以验证结果准确性。

1.3 统计学方法采用统计软件SPSS 22.0，以Hardy-Weinberg（HW）平衡平衡吻合度检验群体的代表性。分析比较病例组与对照组基因型及等位基因频率采用χ2检验，并计算优势比（odds ratio，OR）、95%置信区间（95% confidence interval，95%CI）；近似正态分布的计量资料以均数±标准差表示，两组比较采用独立样本t检验，多组间比较采用方差分析；非正态分布、方差不齐者以中位数M（P25，P75）表示，采用Kruskal-WallisH秩和检验。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 NOD1 rs7789045 基因型目的基因的扩增片段大小为197 bp。经酶切后，AA 基因型为一条带（197 bp），AT 基因型为三条带（197、114、83 bp），TT 基因型为两条带（114、83 bp）。见图1。测序结果与酶切结果相符合，说明目的基因扩增以及酶切准确。见图2。

2.2 NOD1 rs7789045 两组基因型及等位基因频率病例组与对照组基因型、等位基因分布频率均符合Hardy-Weinberg平衡。两组在NOD1 rs7789045各基因型及等位基因分布频率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.3 病例组基因型间临床症状比较79 例病例组3 种基因型临床症状中发热、皮疹、水肿、蛋白尿、关节痛症状发生率比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

2.4 病例组基因型间实验室检验指标比较79 例病例组3 种基因型中实验室检验资料中WBC、Hb、BUN、Scr、Alb 水平差异比较无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

图1 NOD1 rs7789045A/T PCR 产物及3 种基因型电泳图Fig.1 Electropherogram of NOD1 rs7789045A/T PCR product and three genotypes

图2 NOD1 rs7789045 A/T 3 种基因型测序图Fig.2 NOD1 rs7789045 A/T three genotype sequencing map

表1 NOD1 rs7789045A/T 病例组与对照组基因型及等位基因频率比较Tab.1 Comparison of genotype and allele frequency of NOD1 rs7789045A/T case group and control group例（%）

表2 病例组NOD1 rs7789045 A/T3 种基因型临床症状的比较分析Tab.2 Comparative analysis of clinical symptoms of NOD1 rs7789045 A/T three genotypesin the case group 例（%）

3 讨论

AAV 是一种自身免疫性疾病，其主要特征是小血管坏死性炎症和ANCA，可影响全身多系统，严重者危及生命，治疗后易复发［10］。近年来，随着对AAV 认识的不断深入，检测方法和诊断标准的不断完善，其可能对患者生命产生严重性的威胁，AAV 受到了许多学科的广泛关注。然而，不可忽视的是，该疾病的发病机制研究中仍存在许多尚未解决的问题。在使用现有治疗方案治疗后，一些患者仍然难以完全缓解或容易复发。ANCA 是AAV 的重要发病机制，其与韦格纳肉芽肿病之间的联系已得到充分证实［11］。一些学者发现蛋白酶3 抗体刺激可增强人单核细胞中TLR2、3、4、7 和9、NOD1、NOD2 的表达。PR3-ANCA 可通过上调人单核细胞中的TLR 和NOD 信号通路，在各种微生物成分刺激后产生细胞因子，从而部分参与Wegener 肉 芽 肿 的 炎 症 过 程［12］。NOD1 受 体 是NLRs 家族中发现的第一个细胞内PRR，自发现以来一直受到很多关注，主要是因为它在炎症和免疫调节中起重要作用［13］。许多疾病的发病机制与NOD1 的参与密切相关［14-16］。MAJUMDAR 等［14］通过对比检测促炎细胞因子IL8 和IL-1β的mRNA表达，发现NOD1 中的NBD 结构域内SNP 的功能及结构效应可能与溃疡性结肠炎的易感性风险有关。NOD1 受体的激活通过与下游丝苏氨酸酶RIP2 等相关信号蛋白结合，激活NF-κB 等信号通路，促进IL-6 等多种细胞因子的分泌，从而参与免疫反应［14，17］。PLANTINGA 等［18］发现在NOD1 +32656 插入等位基因的类风湿关节炎患者的细胞中促炎细胞因子产生增加，表明NOD1 多态性通过调节Toll 样受体或NOD 样受体配体诱导促炎细胞因子反应。KHARWAR 等［8］也通过病例对照分析发现，NOD1 的纯合基因型（Lys/Lys）与格林-巴利综合征（GBS）存在显着相关，并且也增加了GBS两种亚型的风险，因而发现其可能是GBS 遗传易感性的标记。

表3 病例组患者NOD1 rs77890453 种基因型实验室指标的比较分析Tab.3 Comparative analysis of laboratory indicators of NOD1 rs7789045A/Tthree genotypesin the case group M（P25，P75）

NOD1 是涉及炎症过程的关键分子和治疗方法的合适候选者，但其治疗潜力仅被部分利用。而本文研究探讨的AAV 作为一种累及多个器官系统的自身免疫性疾病，目前其病因和发病机制尚未完全阐明，且目前NOD1 在我国AAV 疾病的分子遗传学方面尚缺乏研究，因此推测NOD1rs7789045 A/T 基因多态性是否可能与AAV 的发生发展有关。本研究使用病例对照分析方法，结果表明，正常人群与AAV 患者在NOD1 rs7789045 中均存在基因多态性，且在3 种基因型及等位基因的分布频率上差异有统计学意义（P＜0.05），表明NOD1 rs7789045 基因多态性可能与AAV 患者的易感性相关。通过比较，发现与AA 基因型相比，携带AT、TT、AT+TT 基因型可能增加了AAV 的发病风险，OR值分别为（OR= 2.31，95%CI：1.14～4.67）、（OR= 2.49，95%CI：1.06～5.85）、（OR= 2.36，95%CI：1.21～4.61）；病例组与对照组A、T 等位基因分布差异有统计学意义（P＜0.05），与A 等位基因相比，T 等位基因可能增加了AAV 的发病风险，OR值为（OR= 1.61，95%CI：1.07～2.42）。这说明携带“T”等位基因可能在AAV 的发生发展中起相关作用。有学者发现，NOD1rs7789045TT 基因型通过与幽门螺杆菌的作用，使胃癌的患病风险增加，可能在促进中国人群中胃癌的发生起重要的作用［19］。在VITTORIO 等［20］的研究中，NOD1 的多态性导致了功能的改变，幽门螺杆菌与NOD1 受体之间相互作用，通过细胞质结构调节胃上皮细胞的免疫炎症和增殖反应，从而影响了潜在病理相关改变的发生。本研究中，NOD1 rs7789045 的差异也存在于病例组与对照组之间，这一结果提示NOD1 rs7789045 风险等位基因“T”可能是参与AAV 发病机制的遗传危险因素之一，但目前NOD1 基因多态性与AAV研究较少，这有待于进一步的研究来验证。本研究的临床症状资料显示，AAV 患者临床症状（发热、皮疹、水肿、蛋白尿、关节痛）的发生率差异无统计学意义（P＞0.05），表明NOD1 rs7789045 A/T 基因多态性可能不影响AAV 患者的上述临床表现。本研究实验室资料结果显示，AAV 患者各基因型之间的临床症状（血白细胞、血红蛋白、血尿素氮、血肌酐、血浆白蛋白）水平比较差异无统计学意义（P＞0.05），说明NOD1 rs7789045 A/T 基因多态性可能不影响AAV 患者的上述实验室资料水平。

随着基因编辑技术的兴起，它为生命医学提供了新的方向，也为许多疾病的基因治疗提供了新的方案［21-22］。例如，炎症性疾病和自身免疫性疾病的治疗虽然处于起步阶段，但随着技术的成熟，人们认为基于基因编辑的特异性治疗无疑将提供新的病理生理学见解和治疗［23-24］。本研究首次证明了NOD1 rs7789045 SNP 与广西汉族人群AAV 的关系。本研究提示使用NOD1 rs7789045A /T 作为干预目标可能为AAV 提供新的治疗方法，为进一步遗传学研究提供依据。

综上所述，NOD1 rs7789045 可能是广西汉族人群中AAV 的易感基因位点。然而，由于样本量小且地理位置有限，NOD1 rs7789045 基因多态性对AAV 的作用机制尚不能得到充分反映。上述结论需要通过扩大区域和样本量来进一步验证。希望基于NOD1 基因多态性的靶向干预策略的深入探索，NOD1 的研究发展将为AAV 的治疗提供新的治疗方法。