血清LncRNA-ENST00000420480在铜绿假单胞菌感染中诊断价值

李有强 张云燕 刘杨 张轩 蔡雪莹 陈茶 罗燕芬

1南方医科大学附属何贤纪念医院检验科（广州511400）；2广州医科大学附属广州市妇女儿童医疗中心口腔科（广州501180）；3广州中医药大学第二临床医学院（广州510006）

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）是一种常见的条件致病菌，目前临床通过细菌分离培养与生化反应鉴定PA，此方法操作复杂，耗时较长［1-2］。寻找简单快速的诊断项目对PA 感染有重要的临床价值。长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）与感染性炎症的发生发展有关［3］，可在血清中被检测，可作为感染性疾病的诊断血清学标志物［4-5］。PA 分泌的信号分子N-3-氧代十二烷酰-L-同型丝氨酸内酯（N-3-oxododecanoy1-L-homoserine lactone，3-O-C12-HSL）可阻碍单核细胞衍生树突细胞（monocytes derived dendritic cells，Mo-DCs）成熟，参与PA 的致病［6］。同时，通过lncRNA 芯片实验发现3-O-C12-HSL 处理的Mo-DCs 中，lncRNA ENST00000420480 变 化 显 著，提示lncRNA-ENST00000420480 参与PA 感染过程。参与致病的lncRNA 往往可作为疾病诊断和预后生物标志物。本文旨在探讨血清中lncRNA-ENST00000420480 在PA 感染中的诊断价值。

1 材料与方法

1.1 材料Trizol、PRIM 1640 和胎牛血清（Life，Carlabad，CA），96 孔细胞培养板、6 孔细胞培养板（Corning，NY）、384 孔平底微量反应板（Life，Carlabad，CA）、8 联PCR 反应管、50 mL 无菌离心管、15 mL 无菌离心管、1.5 mL EP 管（Corning，NY）。

1.2 方法

1.2.1 分离人单核细胞取表观健康人全血100 mL，EDTA-K2 抗凝，密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞，磁珠用前涡旋混匀，按每3 × 107个细胞50 μL 磁珠的量加入抗人CD14+磁珠，室温孵育30 min。用PBS 调整磁珠标记后的细胞浓度为1 × 107～8 × 107个细胞/mL，置于磁力架上，静置10 min，小心吸去上清。

1.2.2 诱导培养Mo-DCs 与分组分选的CD14+细胞加入含10%胎牛血清的PRIM 1640 完全培养基，完全培养基中加入重组人粒-单细胞集落刺激因子和重组人白介素4，终浓度分别为100 ng/mL，重悬后按2 × 106/mL 铺6 孔板。第5天获得未成熟MO-DCs，分三组进行培养：0.1%DMSO 的PBS 组（阴性对照组），0.1 μg /mL 的脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）组（模型组）和0.1 μg /mL 的LPS+25 μmol/L 的3-O-C12-HSL 组（实验组）。

1.2.3 样本的收集实验组纳入标准：经细菌鉴定卡判定为PA。排除上呼吸道定植菌污染，痰涂片经革兰染色为下呼吸道合格痰标本（白细胞＞25 个/每高倍视野同时上皮细胞＜10 个/每低倍视野）且细菌培养未见其他致病菌。收集受试者确诊当天送检红色干燥管或黄色分离胶管，1 500 rpm 离心20 min 分离血清，-80 ℃保存。对照组纳入标准：体检表观健康人，无急慢性炎症，无肝炎，梅毒，艾滋等传染性疾病。收集当天送检红色干燥管或黄色分离胶管，1 500 rpm 离心20 min 分离血清，-80 ℃保存。

1.2.4 提取Mo-DCs 和血清中RNARNA 提取采用Trizol 法。收集培养 的Mo-DCs，每2 × 106个细胞加入1 mL 的Trizol。另外，血清样本为每0.2 mL加入0.8 mL 的Trizol。室温静置10 min 后加入等体积氯仿，震荡涡旋后室温静置5 min，4 ℃下12 000 r/min 离心30 min，吸上清，加入等体积异丙醇，室温静置10 min，4 ℃下12 000 r/min 离心30 min。 弃上清，加入乙醇洗涤后室温干燥，加入20 μL 去RNA 酶水。

1.2.5 qRT-PCR 检测Mo-DCs 和血清lncRNAENST00000420480 表达量参照TaKaRa 逆转录试剂盒说明书（codeNo.RP047A）反转录，按TaKa-Ra SYBR RT-PCR 试剂盒说明书进行操作。lncRNA-ENST00000420480 引物：5′-AAGCAAATCGCATTCCAAAC-3′，5′-TACCTTCACCCTCCCAGCAC-3′；β-actin 引物：5′-GGCGGCACCACCATGTACCCT-3′，5′-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3′。lncRNAENST00000420480 相对定量的计算方法使用2-△△Ct法，qRT-PCR 反应内参为β-actin（ACTB）。在Applied Biosystems ViiA ™7 实 时 定 量PCR 仪 进 行扩增。

1.3 统计学方法采用SPSS 11.0 绘制ROC 曲线，确定lncRNA-ENST00000420480 的诊断临界值及该处诊断指标的特异性和敏感性，计算曲线下面积（AUC）和约登指数（YI），评估lncRNAENST00000420480 的诊断效能。P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3-O-C12-HSL调节Mo-DCs 中lncRNAENST00000420480 表达为明确3-O-C12-HSL 对Mo-DCs 中lncRNA-ENST00000420480 的影响，qRTPCR 实验发现PBS 组相对表达量（2.04 ± 0.18），LPS 组相对表达量为1.00，3-O-C12-HSL 实验组相对表达量为（1.42 ± 0.13）。不同组间差异有统计学意义（F= 50.86，P ＜0.05）。LPS 下调Mo-DCs 中lncRNA-ENST00000420480 表达（P＜0.05），3-O-C12-HSL 上 调Mo-DCs 中lncRNA-ENST00000420480 表达（P＜0.05）。见图1。

图1 Mo-DCs 中lncRNA-ENST00000420480 的表达水平Fig.1 The expression of lncRNA-ENST00000420480 in Mo-DCs

2.2 lncRNA-ENST00000420480 在PA 感染患者中的表达水平为明确PA 感染患者中lncRNAENST00000420480 的表达水平，qRT-PCR检测21例PA 感染患者及32 例健康人血清中lncRNAENST00000420480的表达量。患者年龄28 ～91岁，平均（69.8.1 ± 13.4）岁；健康体检者年龄34 ～89岁，平均（65.0 ± 5.0）岁，见表1。PA 感染组中血清lncRNA-ENST00000420480 相对表达量为（3.85± 4.18），正常组中血清的相对表达量为（1.30 ±1.06）。PA 感染组高于正常组，差异具有统计学意义（t= 19.50，P＜0.05）。

表1 受试者的一般资料Tab.1 The general data of subjects

2.3 lncRNA-ENST00000420480对PA 感染的诊断效能分析为明确血清中lncRNA-ENST00000420480的相对表达量在PA 感染中的诊断效能，绘制ROC 曲线，见图2。 AUC 为0.708（95%CI：0.557～0.860），具有较好的诊断价值（P= 0.01）。相对表达量4.13，其诊断灵敏度与诊断特异度分别为42.9%和100%，YI为0.429，诊断效能最好，表明PA感染的血清学最佳诊断截点为4.13。

3 讨论

图2 血清lncRNA-ENST00000420480 诊断PA 感染的ROC 曲线Fig.2 The ROC curve of serum lncRNA-ENST00000420480 for diagnosis of PA infection

血清中lncRNA 可作为多种疾病的诊断和预后标志物［7-8］。笔者前期发现在PA 分泌的信号分子3-O-C12-HSL 阻碍Mo-DCs 成熟过程中，lncRNAENST00000420480 发生特征性改变，与PBS 组相比，LPS 组下调4.9 倍，3-O-C12-HSL 组上调1.65 倍，提示LncRNA-ENST00000420480 参与PA 的致病。为此，笔者通过qRT-PCR 验证3-O-C12-HSL 阻碍Mo-DCs 成熟过程中lncRNA-ENST00000420480表达水平，发现Mo-DCs 中，LPS 下调lncRNAENST00000420480 表达水平，3-O-C12-HSL 上调lncRNA-ENST00000420480 表达水平。

LncRNA-ENST00000420480 是一种天然反义RNA，由基因反义链转录、与编码链反向互补，以转录后调控的方式调控编码和非编码基因的表达和功能。生物信息学分析发现LncRNAENST00000420480 序列与雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）存在基因重叠区，提示LncRNA-ENST00000420480 作用的靶分子为mTOR。mTOR 是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，mTOR 信号通路介导细胞代谢、生长、增殖和炎症反应等多种细胞功能的调节［9-10］。mTOR 信号通路调节树突细胞的功能，发挥抗炎作用［11］。本研究发现促炎因子LPS 下调LncRNA-ENST00000420480表达，抗炎因子3-O-C12-HSL 可上调LncRNA-ENST 00000420480表达，与预期结果相符。

本研究通过比较21 例临床PA 感染患者血清及32 例健康人血清中lncRNA-ENST00000420480的表达量，发现铜绿假单胞菌PA 感染患者血清中lncRNA-ENST00000420480 高于正常人2.95 倍［（3.85±4.18）vs.（1.30±1.06），P=0.002］，具有较好的诊断价值。当相对表达量为4.13，其灵敏度与特异度分别为42.9%和100%，YI为0.429，诊断效能最好，表明PA 感染的血清学最佳诊断点值为lncRNA-ENST00000420480 相对表达量4.13。

综上所述，通过实时荧光定量PCR 证实3-OC12-HSL 上 调Mo-DCs 中LncRNA-ENST00000420480表达，lncRNA-ENST00000420480 在PA 感染患者血清中表达升高。PA 是社区获得性肺炎的常见病原菌，检测血清中lncRNA-ENST00000420480 的浓度水平有望成为一种简单、快速的方式诊断PA感染。