不同陈酿期松针酵素生物活性变化规律研究

李 彦，周文化 *，罗奡劼，陈嘉琳，陈露茜，刘裕龙，谭越兮

（1.中南林业科技大学 特医食品加工湖南省重点实验室，湖南 长沙 410004；2.中南林业科技大学食品科学与工程学院，湖南 长沙 410004；3.湖南恩松生物科技有限公司，湖南 湘潭 411100）

松针（Pinus armandiFranch）为松科（Pinaceae）松属（Pinus）植物的叶，含有丰富的营养物质和生理活性成分，具有镇咳、祛痰、抗突变、降血脂、降血压、抗衰老、消炎抑菌等[1]作用。松针在我国分布广泛，价格低廉，将松针资源进行深度开发和利用具有重要的意义。

酵素食品是指以一种或多种新鲜蔬菜、水果、菌菇、药食同源中草药等为原料，经多种有益菌发酵而成的功能性产品，含有丰富的酶、维生素、矿物质和次生代谢产物等营养成分[2]，具有抗氧化[3]、美白[4]、增强免疫力[5]及改善肥胖[6]的功效。近年来，关于酵素酶系及抗氧化活性研究较多，如张梦梅等[7]检测了市售酵素的酶系；赵光远等[8]研究了红枣酵素在发酵过程中的活性酶系及相关代谢产物的变化规律；王辉等[9]研究了青梅酵素的抗氧化活性、活性酶系及抑菌效果等，这些报道集中在某种酵素的活性物质的检测或是发酵过程中活性物质的变化研究，关于酵素陈酿期间生物活性的变化研究鲜有报道。

本研究以不同陈酿期的松针酵素为研究对象，采用国标中的方法及试剂盒准确测定松针酵素中的活性酶系，并以还原力、超氧阴离子自由基（O2-·）清除能力、羟基自由基（·OH）清除能力、1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力和2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（2,2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate，ABTS）自由基清除能力为抗氧化性指标对松针酵素的抗氧化性能进行检测分析。以期探讨松针酵素陈酿过程中活性酶系及抗氧化活性的变化规律，科学评价松针酵素的抗氧化活性及其品质，为评估松针酵素的功能及产品质量的改善提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料与菌株

松针、松花粉、松子、沙棘、柚子、胡萝卜、菊花、柠檬、橘子、玫瑰花、桂花：湖南恩松生物科技有限公司；安琪牌葡萄酒用高活性干酵母、发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）CECT5716、短双歧杆菌（Bifidobacterium breve）M-16V：中科院微生物研究所。

1.1.2 试剂

DPPH、乙醇、ABTS、过硫酸钾、铁氰化钾、三氯化铁、硫酸亚铁、水杨酸、双氧水、Tris、邻苯三酚、淀粉酶试剂盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒、盐酸、酪蛋白、酪氨酸、福林酚、碳酸钠、三氯乙酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、聚乙烯醇、橄榄油、磷酸二氢钾、氢氧化钠、乙酸、乙酸钠、葡萄糖、羧甲基纤维素钠、无水硫酸钠、酒石酸钠、苯酚、3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）：国药集团化学试剂有限公司。实验所用试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

YP-B10001分析天平：上海光正医疗仪器有限公司；BlueStar B紫外可见分光光度计：北京莱伯泰科仪器股份有限公司；PHSJ-3FpH计：上海圣科仪器设备有限公司；TG16MW台式高速冷冻离心机：湖南赫西仪器装备有限公司；84-1磁力搅拌器：上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司；FA25-D剪切机：上海弗鲁克科技发展公司；BET-40生化培养箱：天津天大天发科技有限公司；SpectraMa酶标仪：美国Molecular Device公司。

1.3 实验方法

1.3.1 松针酵素制备工艺流程及操作要点

原料→清洗→热烫、沥干→研磨→酵母发酵→混合发酵→后熟→松针酵素

操作要点：选取松针、松花粉、松子等原料，用清水洗涤后热烫15 min，冷却沥干后加水研磨得到混合果浆，加入22%红糖和33%冰糖，溶解均匀，再加入0.8%活化后的干酵母，置于22 ℃条件下发酵18 d，再接种6%短双岐杆菌M-16V和发酵乳杆菌CECT5716的混合菌液（短双岐杆菌M-16V∶发酵乳杆菌CECT5716=1.0∶1.5），混合发酵结束后即得松针酵素成品。松针酵素于4 ℃低温陈酿，分别取陈酿半年、一年、两年、三年、四年的松针酵素，4 000 r/min、4 ℃条件下离心15 min，取上清液测定各指标。

1.3.2 活性酶的测定

蛋白酶：参照SB/T 10317—1999《蛋白酶活力测定法》，以酪氨酸的质量浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标绘制酪氨酸标准曲线，按照标准曲线回归方程y=0.174 8x-0.055 6（R2=0.999 1）计算样品中酪氨酸的含量。蛋白酶活力定义：在40 ℃条件下每分钟水解酪蛋白产生l μg酪氨酸定义为1个蛋白酶活力单位（U）。

纤维素酶：参照NY/T 912—2004《纤维素酶活力的测定-分光光度计法》，以葡萄糖的质量浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标绘制葡萄糖标准曲线，按照标准曲线回归方程y=0.907 3x+0.085 5（R2=0.999 6）计算样品中纤维素酶水解羧甲基纤维素钠产生的还原糖含量，再根据公式换算成样品中纤维素酶的含量。纤维素酶活力定义：在37℃、pH值为5.5的条件下，每分钟从质量浓度为4 mg/mL的羧甲基纤维素钠溶液中降解释放1 μmol还原糖所需的酶量为一个酶活力单位（U）。

脂肪酶：参照GB/T 23535—2009《脂肪酶制剂》中的电位滴定法测定。脂肪酶活力定义：1 g固体酶粉（或1 mL液体酶），在一定温度和pH值条件下，1 min水解底物产生1 mol可滴定的脂肪酸即为1个酶活力单位（U）。

淀粉酶：参考淀粉酶试剂盒内说明书测定。淀粉酶活力定义：在60 ℃、pH值6.0的条件下，1 h液化1 g可溶性淀粉所需的酶量为一个酶活力单位（U）。

SOD：参考SOD试剂盒内说明书测定。SOD活力定义：25 ℃时抑制邻苯三酚自氧化速率50%时所需的SOD量为一个活力单位（U）。

1.3.3 抗氧化能力的测定

DPPH自由基清除能力的测定参考SHARMA O P等[10]的方法；ABTS自由基清除能力的测定参照MUSTAFA O等[11]的方法；羟基自由基清除能力的测定参照SHUANG L X等[12]的方法；超氧自由基清除能力的测定参照DU G等[13]的方法；还原力的测定参考SABOKBAR N等[14]的方法。

1.3.4 数据处理

在Excel 2013中对试验数据进行整理。采用OriginPro8.0分析软件对数据进行差异显著性分析及相关性分析。

2 结果与分析

2.1 松针酵素陈酿期间活性酶的变化

酵母菌发酵混合果浆不但保留了原材料中的营养成分，而且通过微生物的代谢产生了新的活性酶，赋予了松针酵素极强的保健功能，这些活性酶主要包括SOD、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶。SOD是一种特殊的金属酶，能有效清除机体内的的超氧阴离子自由基，对生物体来说是一道保护屏障，且具有抗氧化、防衰老、抗辐射等多种功效，广泛应用于医药领域[15]；蛋白酶不仅能促进蛋白质的水解，还能分解濒临凋亡的细胞，具有促消化和美容的功效[16]；脂肪酶是一类水解油脂的酶类，主要作用于油脂中的脂肪酸和甘油相连接的酯键，水解底物一般为天然油脂，广泛应用于减肥产品及保健品中[17]；淀粉酶能够催化淀粉水解，具有促进人体消化的功能；纤维素酶能够将纤维素分解为葡萄糖，改善人体的消化系统。松针酵素陈酿期间活性酶活力的变化见图1。

图1 松针酵素陈酿期间活性酶活力的变化Fig.1 Changes of active enzyme activities in pine needle Jiaosu during aging periods

由图1可知，在松针酵素中存在SOD、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶和纤维素酶，且5种酶活性均随陈酿时间的延长逐渐降低。与之前研究相符，不同陈酿期松针酵素的蛋白质含量随着陈酿时间的延长而降低[18]。陈酿初期，蛋白酶活力和SOD活力较高，分别为427.66 U/mL、258.67 U/mL；淀粉酶、纤维素酶以及脂肪酶活力较低，分别为12.95 U/mL、6.92 U/mL和1.90 U/mL。陈酿末期，蛋白酶活力最高，其次是SOD、纤维素酶和淀粉酶，脂肪酶活力最低，分别为241.54 U/mL、163.51 U/mL、4.98 U/mL、1.52 U/mL、0.33 U/mL。在整个陈酿期间，淀粉酶和脂肪酶活力下降最多，分别下降88.26%和82.63%；蛋白酶、SOD、纤维素酶活力分别下降43.52%、36.79%、28.03%。

董银卯等[3]使用酵母菌发酵制备火龙果酵素，测得其SOD、淀粉酶和脂肪酶活力分别为300 U/mL、33.2 U/mL、1.8 U/mL；周偏等[19]研究发现，诺丽酵素活性较高，其中SOD活性和淀粉酶活性分别达到376.43U/mL和17.65U/mL；崔国庭等[20]研究发现，草莓酵素的SOD活力为35.4 U/mL，淀粉酶活力为3.26 U/mL；邵颖等[21]考察了植物酵素发酵过程中SOD、纤维素酶、蛋白酶等几种酶活性的变化规律，发现在发酵终点时，SOD活力为（49.29±2.02）U/mL、纤维素酶活力为（319.71±8.19）U/mL、蛋白酶活力为（12.51±1.31）U/mL。与火龙果酵素相比，松针酵素中的SOD、淀粉酶活力略低，但脂肪酶活力相差不大；与诺丽酵素相比，SOD及淀粉酶活性较弱；松针酵素中的SOD及蛋白酶活性高于植物酵素，但纤维素酶活性却低于植物酵素；草莓酵素中的SOD及淀粉酶活性远不及松针酵素。各个酵素中酶活力出现不同的原因，可能是由于酵素生产工艺的不同，如高温杀菌致使酵素中的酶失活；也有可能是原料种类及比例的不同，在未发酵之前，原料本身含有的活性物质会有很大的差异；还有可能是菌种的选择、发酵方式、发酵时间的不同引起的。

2.2 松针酵素陈酿期间抗氧化能力的变化趋势

松针酵素经酵母发酵、短双歧杆菌和发酵乳杆菌混合发酵后得到具有较高活性物质以及活性酶的松针发酵液，这些功能活性成分会增加松针发酵液的体外抗氧化活性，通过对发酵过程中各类抗氧化活性指标（还原力、ABTS自由基清除能力、DPPH自由基清除能力、超氧阴离子自由基清除能力及羟基自由基清除能力）的检测，从而判断松针酵素在陈酿期抗氧化活性的变化趋势。

2.2.1 松针酵素陈酿期间还原力的变化趋势

图2 松针酵素陈酿期间还原力的变化趋势Fig.2 Change of reducing power of pine needle Jiaosu during aging periods

由图2可知，随着陈酿时间的延长，松针酵素还原力逐渐减小，还原力由最初的0.54下降至0.39，下降27.78%，说明陈酿会导致松针酵素还原能力减弱。分析原因可能是陈酿期间发酵体系中各分子进行氧化还原、酯化、缩合、聚合等一系列反应，导致还原能力减弱。

2.2.2 松针酵素陈酿期间超氧阴离子自由基清除率的变化趋势

图3 松针酵素陈酿期间超氧阴离子自由基清除率的变化趋势Fig.3 Change of superoxide anion radical scavenging rate of pine needle Jiaosu during aging periods

由图3可知，陈酿半年的松针酵素对超氧阴离子自由基清除能力高达92.93%，随着陈酿时间的延长，呈现稍有下降的趋势，总体下降6.9%。分析原因可能与陈酿期间SOD活力不断下降有关，ZYRACKA E等[15]研究表明，SOD能催化超氧阴离子自由基发生歧化反应，从而达到清除超氧阴离子自由基的目的；另一方面可能是因为陈酿期间发酵液体系中活性物质持续下降。

2.2.3 松针酵素陈酿期间羟基自由基清除率的变化趋势

图4 松针酵素陈酿期间羟基自由基清除率的变化趋势Fig.4 Change of hydroxyl radical scavenging rate of pine needle Jiaosu during aging periods

由图4可知，陈酿半年的松针酵素对羟基自由基清除能力最高达60.57%，但随着陈酿期的延长羟基自由基清除能力不断减弱，陈酿第4年羟基自由基清除率只有31.77%，总体下降28.8%。其原因可能是陈酿期间松针酵素中的营养物质不断下降，发酵菌的生长繁殖受到抑制，产生可以清除羟基自由基的抗氧化酶类也随之减少；也有文献报道，发酵菌本身就具备抗氧化能力，如酵母菌的细胞多糖能有效清除羟基自由基[22]。LEE J等[23]研究发现，黄酮类化合物能有效清除羟基和超氧阴离子自由基，与金属形成复合物，并抑制金属引发的脂质氧化。因此，松针酵素对羟基自由基清除能力与发酵菌、抗氧化酶类以及黄酮类化合物有关。

2.2.4 松针酵素陈酿期间DPPH自由基清除率的变化趋势

图5 松针酵素陈酿期间DPPH自由基清除率的变化趋势Fig.5 Change of DPPH radical scavenging rate of pine needle Jiaosu during aging periods

由图5可知，松针酵素的DPPH自由基清除能力随着陈酿时间的延长呈升高后略下降的趋势。韦仕静等[24-25]研究发现，酚类物质含量与DPPH自由基清除率呈一定的相关性；SHAHIDI F等[25]研究发现，有机酸、维生素和具有自由羟基的酚类物质都可以有效清除自由基。因此，松针酵素对DPPH自由基的清除能力不仅与发酵液体系中的多酚物质有关，还与有机酸、维生素等其他活性物质相关。

2.2.5 松针酵素陈酿期间ABTS自由基清除率的变化趋势

图6 松针酵素陈酿期间ABTS自由基清除率的变化趋势Fig.6 Change of ABTS radical scavenging rate of pine needle Jiaosu during aging periods

由图6可知，松针酵素对ABTS自由基清除率高达98.91%，且在陈酿期间，变化较小，说明不同陈酿时间松针酵素发酵液均表现出很强的ABTS自由基清除能力，且对ABTS的清除能力非常稳定。孙淑夷[26]研究发现，荔枝汁酵素在发酵16 h后ABTS自由基清除率高达98%，发酵16 h后ABTS自由基清除率较为稳定；陈小伟等[27]研究发现，不同发酵时间诺丽酵素对ABTS自由基的清除率差异不大。因此，松针酵素不仅对ABTS自由基的清除率高，且能在一定时间范围内保持稳定。

综上，松针酵素的抗氧化活性随着陈酿时间的延长而降低，但对DPPH自由基的清除率稍有增加。

2.3 松针酵素陈酿过程中活性酶和抗氧化能力的相关性分析

采用Pearson法对松针酵素陈酿过程中脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、SOD和纤维素酶与DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、超氧阴离子自由基清除能力、羟基自由基清除能力和总还原力能力的相关性进行分析，结果见表1。

由表1可知，DPPH、超氧阴离子自由基清除能力与羟基自由基清除能力、淀粉酶活力及蛋白酶活力呈显著相关（P＜0.05），DPPH自由基清除能力与纤维素酶活力呈极显著相关（P＜0.01），超氧阴离子自由基清除能力与还原力呈极显著相关（P＜0.01），与SOD活力呈显著相关（P＜0.05）；羟基自由基清除能力除与ABTS自由基清除能力无显著相关外（P＞0.05），与其他指标都相关，其中与还原力、淀粉酶活力及SOD活力呈极显著相关（P＜0.01）；还原力与SOD活力呈极显著相关（P＜0.01）；脂肪酶活力与淀粉酶活力、蛋白酶活力呈极显著相关（P＜0.01）；淀粉酶与蛋白酶活力呈极显著相关（P＜0.01）；ABTS与各指标无显著相关性（P＞0.05）。5种活性酶活力与5个抗氧化指标具有一定的相关性，可以通过测定松针酵素中的活性酶含量来表征其抗氧化特性。

表1 松针酵素中活性酶和抗氧化能力的相关性分析Table 1 Correlation analysis of active enzymes and antioxidant ability in pine needle Jiaosu

3 结论

不同陈酿期松针酵素中含有丰富的活性酶类，包括SOD、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶和纤维素酶，在陈酿初期，5种酶活力最高，分别为258.67 U/mL、12.95 U/mL、427.66 U/mL、1.90 U/mL、6.92 U/mL；但随陈酿时间的延长，5种活性酶活力均逐渐降低，酶活力分别下降36.79%、88.26%、43.52%、82.63%、28.03%。

不同陈酿期松针酵素具有良好的抗氧化能力，在整个陈酿期间，对超氧阴离子自由基清除能力和ABTS自由基清除能力均＞85%，相对稳定。随着陈酿时间的延长，还原力和羟基自由基清除能力减弱，而DPPH自由基清除能力增加。

松针酵素活性酶与抗氧化性相关分析结果表明，5种活性酶活力与5个抗氧化指标具有一定的相关性，可以通过测定松针酵素中的活性酶含量来表征其抗氧化特性。