高效液相色谱法测定山苓健胃颗粒中甘草酸的含量

唐棣，金明露，葛荣，贺超

(四川省兽药监察所，成都 610041)

山苓健胃颗粒是运用中兽医传统理论研制的中兽药三类新药，处方由山楂、茯苓、甘草等药材组成，采用提取精制的方法制成中药颗粒剂，具有开胃消滞、健脾除湿之效，用于防治仔猪积滞，脾运失常的脾胃病。经反复试验研究并查找文献资料，证实处方中甘草除具有益气和中的功效外，还具有对脾虚症的治疗作用，其原理是通过使肠上皮细胞的增值凋亡、黏膜的保护修复达到治愈脾虚状态下的胃肠黏膜组织出现的病理性损伤[1]。本试验拟建立山苓健胃颗粒中甘草的含量测定方法以控制山苓健胃颗粒的质量，为了更准确的反映甘草调和补脾益气和胃的主要药理活性成分，研究建立了采用反相高效液相法测定山苓健胃颗粒中甘草酸含量的方法。

1 仪器与材料

1.1 仪器 安捷伦1100型高效液相色谱仪，岛津LC20高效液相色谱仪；色谱柱AgilentXDB-C18 (5 μm，250 mm×4.6 mm)，Kromasil 100-5-C18 (5 μm，250 mm×4.6 mm)；电子天平(型号BP211D)购自德国塞托里斯公司。

1.2 试药与试剂 甘草酸铵对照品(批号为110731-201619，标示含量为93.0%)来源于中国食品药品检定研究院；山苓健胃颗粒样品(每1 g相当于原生药3.461 g)三批，批号分别为20140609、20140610、20140611，来源于XX动物保健科技有限公司；甲醇(色谱纯，Thermo fisher公司，批号：201505026)；冰醋酸，天津市科密欧化学试剂有限公司生产；水为纯化水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 流动相：甲醇-0.2 mol/L醋酸铵溶液-冰醋酸(65∶35∶1)；流速：1.0 mL/min；检测波长250 nm；柱温：室温；进样量：20 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 取甘草酸铵对照品适量，精密称定，加流动相制成每1 mL含甘草酸铵16 μg(相当于甘草酸15.67 μg)的溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备 取本品研细的粉末0.70 g，精密称定，置50 mL量瓶中，加流动相约45 mL，超声处理(功率300 W，频率40 kHz)30 min，放冷，加流动相至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性对照溶液的制备 按处方及制法制备不含甘草的阴性制剂，取阴性制剂，按供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。

2.3 系统适用性和专属性试验 精密量取上述对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液各20 μL，注入液相色谱仪，按2.1项色谱条件测定，结果理论塔板数以甘草酸峰计算为9298，在供试品色谱图中甘草酸峰与相邻峰分离良好，分离度为2.92，阴性对照色谱在与对照品色谱相同保留时间处无干扰峰(图1)。结果表明，系统适用性满足检测要求；处方中其他成分对甘草酸定量检测无干扰，专属性能满足检测要求。

图1 专属性试验色谱图(A、B、C分别为甘草酸对照品、 山苓健胃颗粒样品、缺甘草阴性样品)Fig 1 HPLC chromatograms of specific test (A: glycyrrhizic acid B: the sample C: licorice negative control)

2.4 线性关系考察 取甘草酸铵对照品贮备液(相当于甘草酸浓度0.3274 mg/mL)，精密量取1、1、3、5、1、3 mL，分别置100、50、100、100、10、20 mL量瓶中，分别加流动相至刻度，摇匀，制备的对照品溶液浓度分别为3.274、6.548、9.822、16.37、32.74、49.11 μg/mL。按上述色谱条件，分别进样20 μL，测定峰面积。以峰面积为纵坐标(Y)，以进样浓度为横坐标(X)，进行线性回归，得回归方程Y=8.3005X-6.5611，r=0.9996(n=6)，甘草酸在3.274～49.11 μg/mL范围内线性关系良好。

2.5 准确度 采用加标回收的方法，在已知含量的山苓健胃颗粒中，加入一定质量的甘草酸铵对照品，按供试品溶液制备方法制备，使其制备后在供试品中的量为其限度值的80%、100%和120%，共制备9份。再按2.1项色谱条件测定峰面积，计算甘草酸的量，用实测值与供试品中含量之差，除以加入对照品量，计算甘草酸回收率，即得。回收率R(100%)=(实测量-供试品中含有量)/添加量×100%，测定结果表明，甘草酸的回收率在98.2%～102.6%之间，平均回收率为99.9%，RSD为1.30%，结果见表1。

表1 加样回收率试验Tab 1 Recovries of glycyrrhizic acid in preparation

2.6 精密度 取供试品(批号为20140609)溶液，精密量取20 μL，按2.1项色谱条件重复进样6次，测得甘草酸峰面积RSD为1.30%，结果见表2。

表2 精密度试验Tab 2 Precision test

2.7 耐用性 取同一批山苓健胃颗粒(批号为20140609)样品，按2.2项下方法制成供试品溶液，保持流动相比例和流速不变，在岛津LC20高效液相色谱仪和Agilent1100色谱仪上分别使用Kromasil 100-5-C18 (5 μm，250 mm×4.6 mm)和Agilent XDB-C18(4.6 mm×150 mm,5 um)色谱柱，于20、30、40 ℃条件下进行测试，考察方法的耐用性，结果表明该方法能够耐受不同液相色谱仪、色谱柱、柱温等因素的小范围变化，测得山苓健胃颗粒中甘草酸的含量无明显差异，耐用性良好，结果见表3。

表3 耐用性试验Tab 3 serviceability test

2.8 稳定性试验 取供试品(批号为20140609)的样品，按2.2项下方法制成供试品溶液，立即测定，再在2、4、6、8、10 h进行测定，结果RSD为0.45%，表明测定值在10 h内基本稳定，结果见表4。

表4 稳定性试验Tab 4 Stability test

2.9 样品含量测定 取3批山苓健胃颗粒(批号分别为20140609、20140610、20140611)分别按2.2项下方法制备供试品溶液，精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20 μL，上机测定峰面积，通过外标法计算甘草酸的含量，结果见表5。

表5 样品含量测定结果(mg/g)Tab 5 Content determination results (unit：mg/g)

3 讨论与结论

3.1 含量测定成分的选择 山苓健胃颗粒处方源于民间验方，由山楂、茯苓、甘草等药材组成，采用提取精制的方法制成中药颗粒剂，具有开胃消滞，健脾除湿之效，用于防治仔猪积滞，脾运失常的脾胃病。因其处方中的山药、茯苓等未能建立高效准确的液相检验方法，因此，选择甘草作为山苓健胃颗粒的含量测定指标。甘草中含有多种黄酮类化合物、三萜类化合物及香豆素、生物碱、氯基酸、雌性激素、有机酸等多种成分[2-3]。其中三萜类化合物甘草酸是主要活性成分，其含量为5%～11%左右[4]。多项研究表明甘草的主要活性成分三萜类(甘草酸类)能促进胃肠运动并保护肝脏，甘草酸可明显阻止四氯化碳、术后内毒素、脂多糖等物质诱导的肝细胞损伤，并能抑制实验性肝纤维和早期肝硬化的发生。脾虚状态下，甘草酸能作用肠上皮细胞增值凋亡、促进黏膜起保护修复作用[1]。因此，山苓健胃颗粒中含量测定的成分选择甘草酸。采用HPLC 测定山苓健胃颗粒中甘草酸的含量，操作简便，甘草酸在3.274～49.11 μg/mL范围内线性关系良好，检测方法的准确度、精密度、日内稳定性和耐用性均能达到要求。

3.2 样品前处理方法的选择 甘草酸一般以钾盐或钙盐的形式存在于甘草中，具有显著的生物活性。其提取分离方法主要有稀氨水提取法，氨性醇提取法，酸水提取法，微波提取法等方法[5-6]。参考2015年版《中华人民共和国兽药典》[7]二部甘草颗粒含量测定项下前处理方法，本试验采用酸性甲醇作为溶剂，超声处理30 min，结果证明该方法能够较为完全地提取出山苓健胃颗粒中的甘草酸，并且阴性对照无干扰。

3.3 色谱方法的选择 色谱方法中流动相各组分经反复试验筛选，最后采用了甲醇-0.2 mol/L醋酸铵溶液-冰醋酸(65∶35∶1)的比例，处方中各有效成分峰的分离度最好，理论板数符合液相色谱分析要求，流速为1.0 mL/min条件下，方法稳定，重现性好。

高效液相法测定山苓健胃颗粒中甘草酸的含量，方法简便，准确，灵敏度高，回收率好，可有效控制该制剂中甘草的含量。