我国猪圆环病毒3 型流行现状分析及实验室诊断技术研究进展

李 娇，祖立闯，王文秀，李 峰，沈志强，

（1. 山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600；2. 山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600）

猪圆环病毒（Porcine circovirus, PCV）属于圆环病毒科（Circoviridae）圆环病毒属（Circovirus）成员，为无囊膜、单股环状的DNA 病毒，是迄今发现的最小动物病毒[1]。过去确定的PCV 有两种基因型，即猪圆环病毒1 型（PCV1）和圆环病毒2 型（PCV2），PCV1 不产生细胞病变，对猪无致病性；PCV2 感染与临床中的断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎肾病综合征、猪呼吸道病综合征、肉芽肿性肠炎、坏死性淋巴结炎、渗出性皮炎、繁殖障碍等疾病密切相关，统称为猪圆环病毒病（Porcine circovirus disease,PCVD）或猪圆环病毒相关疾病（Porcine circovirus associated diseases, PCVAD）[2]。PCV2 感染后可在猪只淋巴系统中增殖并引起免疫细胞损伤，是引起猪群免疫抑制性疾病的主要病原之一，由PCV2 引起的猪圆环病毒相关疾病给全球养猪业造成了重大经济损失，具有养猪业的“隐形杀手”之称。2015 年6月，美国北卡罗来纳州某商品化猪场发生猪皮炎肾病综合征和繁殖障碍疫情，主要表现在母猪死亡率升高10.2%，受孕率下降0.6%，患病母猪厌食、皮肤呈现多灶性丘疹、斑点和浅表性皮炎，产弱胎、死胎和木乃伊胎。Palinski 等[3]从患病母猪及流产胎儿体内首次检测出一种新病毒，并通过宏基因组测序及遗传进化分析将其分类于一种新型猪圆环病毒，命名为猪圆环病毒3 型（PCV3），随后我国研究学者陆续在湖北、广东等发生繁殖障碍母猪以及急性死亡仔猪体内也检测出PCV3。鉴于PCV2 过去对我国养猪业造成的巨大危害，PCV3 一经发现就引起了我国研究学者的高度重视和密切关注，业界甚至普遍认为PCV3 将是继PCV2 之后未来几年内危害我国养猪业较为严重的传染病之一。本文就目前PCV3 的病原学特征、流行现状及实验室诊断技术的最新研究进展进行综述，旨在掌握我国猪群中PCV3 的流行现状与流行特点，对逐步提高我国PCV3 实验室诊断水平，以及对我国PCV3 综合防控的制定均具有重要的参考价值。

1 病原学特征

与PCV1 和PCV2 一样，PCV3 为无囊膜、单股环状的DNA 病毒，病毒基因组全长2.0 kb，包含3个主要开放阅读框（ORF），分别编码与PCV1 和PCV2 同源的Rep 蛋白、Cap 蛋白和一个特有的ORF3 蛋白[4]。圆环病毒属的病毒粒子理化性质相似，PCV3病毒粒子呈二十面体结构，直径为17～20 nm，病毒对氯仿、乙醚等有机溶剂均具有一定的抵抗力，在pH 3.0 酸性环境条件下及70 ℃高温环境下均能存活一段时间。虽然目前PCV3 通过何种途经传播尚未明确，但Palinski 等[3]从患病母猪及流产胎儿体内均检测到PCV3，揭示怀孕母猪感染PCV3 后，可经胎盘垂直传染仔猪；Ku 等[5]从猪精液中检出PCV3，揭示PCV3 也可以通过精液传播，表明PCV3 可垂直传播。由于PCV2 可随患病猪的呼吸道、消化道和泌尿生殖道分泌物排出，经直接或间接接触方式传播，提示PCV3 也有可能通过水平方式传播，这需要进一步的详细研究确定。在易感动物方面，从目前的研究资料来看不同年龄、性别的猪均可感染PCV3，但以妊娠母猪和仔猪更易感。

2 流行病学监测情况

随着PCV3 的日益流行以及我国对PCV3 感染的逐步重视，我国研究学者对国内PCV3 的感染情况进行了大量的流行病学监测，笔者通过对监测结果的整理汇总，分析出我国猪群PCV3 流行的几个显著特点。

2.1 流行范围广

如表1 所示，PCV3 的流行范围已经遍布了我国山东、浙江、安徽、江苏、江西、湖南、湖北、福建、河南、吉林、广西、贵州、广东、海南、上海、四川、云南等17 个省市。

表1 我国PCV3 流行病学监测情况汇总

2.2 不同区域感染率差异较大

如表1 所示，不同地区PCV3 的感染率差异较大，呈现出显著的区域性流行特点。如2017 年广东、海南、广西、湖南等华南地区的感染率高达46.3%，而2017 年河南驻马店市的感染率仅为4.17%；如2016—2017 年广西省的感染率高达24.31%，而2016—2017 年贵州省和河南省的感染率仅为4.87%和4.61%。

2.3 与其他病原的混合感染情况较严重

如表2 所示，PCV3 与PCV2、猪繁殖与呼吸综合征（PRRSV）、猪瘟（CSFV）普遍存在二重、三重的混合感染，其中在部分地区PCV3 与PCV2 混合感染率高达30.26%，混合感染增加了疫病的诊断与防控难度，造成的经济损失更加巨大，应加强重视。

表2 我国猪群中PCV3 与其它致病原混合感染情况汇总

3 分子流行病学研究情况

分子流行病学研究可以从分子水平发现PCV3 流行病毒株之间的差异以及遗传和衍化规律，明确PCV3 不同流行毒株的基因亚型与变异情况，揭示PCV3 与PCV2 的交叉保护效果，能够为不同地区因地制宜地制定防控措施提供指导依据。贺会利等[22]对PCR 检测为PCV3 阳性的广西猪病料样品进行PCV3 Cap 基因的遗传变异分析，该Cap 基因与GenBank 中登录的18 株PCV3 毒株Cap 基因序列同源性分别在96.9%～99.5%之间，属于3b 压群，而与PCV1 毒株和PCV2 毒株的核苷酸序列同源性仅有43.0%和45.8%，且B 细胞抗原表位差异明显，在PCV1 特有的B 细胞抗原表位（92～103 aa）、PCV2 特有的B 细胞抗原表位（69～83 aa、117～131 aa 和231～233 aa）及PCV1、PCV2 共 有 的B 细 胞 抗 原 表 位（156 ～162 aa 和179～192 aa）均无相似性，鉴于PCV3 与PCV2 在核衣壳Cap 蛋白的抗原表位上无任何相似性，推测PCV3 毒株和PCV2 毒株的抗原交叉保护性极低，现有的PCV2 疫苗无法为PCV3 感染提供有效的免疫保护作用，已商品化的PCV2 血清抗体检测试剂盒也无法对PCV3 感染的抗体滴度进行检测。湛洋等[7]对2 株PCV3 Cap 基因进行遗传变异和抗原性预测分析，结果表明2 个Cap 基因均属于PCV3 毒株，与GenBank 中参考的PCV3 Cap 基因序列同源性均在97%以上，Cap 蛋白的氨基酸序列与5 个美国报道的PCV3 参考毒株的Cap 蛋白氨基酸相似性达98%，与PCV2 Cap 蛋白氨基酸相似性仅为30%；三维结构预测显示，尽管PCV3 Cap 蛋白也包含一个jelly roll 折叠，但与PCV2 Cap 蛋白表面结构的差异很大，这种结构的差异进一步会对构象型表位的识别产生影响，与PCV2 Cap 蛋白质亚基相比，PCV3 Cap 蛋白质亚基含有更多的loops 结构，在圆环病毒侵染细胞的时候，核衣壳Cap 蛋白参与了病毒与宿主细胞的相互作用，这些loops 结构是由非典型的二级结构组成，在与宿主细胞蛋白质相互作用过程中展现出高度的动态性，因而使得其致病机制更加复杂。根据上述抗原性和结构分析，PCV3 和PCV2 Cap 蛋白质不具有共同的线性抗原表位，PCV3 和PCV2 之间不具有交叉免疫保护，提示常规PCV2 疫苗对PCV3 的流行无法提供良好的免疫保护，需要开发新型疫苗以及制定更具针对性的防控措施来控制PCV3 的流行与暴发。

4 实验室诊断技术

鉴于PCV3 与PCV2 引起的临床表现极其相似，二者均可引起猪的皮炎肾病综合征、繁殖障碍以及心脏和多系统的炎症反应。患病母猪表现厌食，皮肤出现多灶性丘疹、斑点和浅表性皮炎，死亡率增加，受孕率降低，生产性能下降，流产率增加，产弱胎、死胎、木乃伊胎。仔猪可主要表现为呼吸、泌尿、肠道、淋巴、心血管、神经、繁殖系统以及皮肤的功能紊乱等系列症状，且在临床中二者具有一定的混合感染率，增加了PCV3 临床诊断的难度，故目前对PCV3 感染的确诊主要依靠实验室诊断技术，包括分子生物学诊断技术和免疫学诊断技术。

4.1 分子生物学诊断方法

分子生物学检测方法可以检测到病原体特定的核苷酸序列，且具有简便、高效、灵敏、特异等优点，在动物疫病诊断方面的应用越来越广泛，逐步成为动物疫病诊断的主流方法，尤其在新发动物疫病的诊断方面显示出了巨大的优越性。目前，用于PCV3 的分子生物学诊断方法主要有PCR 方法、套式PCR 方法、荧光定量PCR 方法和LAMP 方法。

4.1.1 PCR 方法 PCR 技术指在DNA 聚合酶催化下，以母链DNA 为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA 互补的子链DNA 的过程，是一项DNA 体外合成放大技术，能快速、特异地在体外扩增DNA。徐朋丽等[23]根据GenBank 中PCV3 全基因序列在其保守区设计1 对特异性引物，并优化反应条件，建立了检测PCV3 的PCR 方法，该方法仅对PCV3 检测为阳性，而检测PCV2、PRRSV、CSFV、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）等其它常见病原均为阴性，对PCV3 的最低检出量为61.9 拷贝/μL，应用该方法检测133 份临床样品，PCV3 阳性感染率为29%，该方法的建立使PCV3 的检测更为快速、简便、经济、实用，为PCV3感染的早期诊断提供了有力的技术支持。

4.1.2 套式PCR 方法 套式PCR 技术是常规PCR的一种改进模式，其先利用外引物进行一轮PCR 扩增反应，再以外引物的PCR 扩增产物为模板，利用内引物进行第二轮PCR 扩增反应，通过第二轮PCR扩增一方面可有效降低或避免了临床病料样品中大量的蛋白和脂类对PCR 扩增反应的影响，另一方面因其已经进行了一次核酸的体外扩增，模板中的核酸含量显著升高，PCR 的敏感性将大幅提高。杨永宁等[24]根据GenBank 中PCV3 基因序列，设计合成内外2 对引物，经过套式PCR 反应条件的优化，建立了检测PCV3 的套式PCR 方法，该方法检测PCV2、PRRSV、CSFV、PRV、PPV、PEDV、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）均为阴性，外引物扩增的检测灵敏度为17 ng DNA，内引物扩增的检测灵敏度为0.17 ng DNA，该方法在检测124 份临床病料样品的应用中，外引物共检测出阳性样品22 份，内引物共检测出阳性样品28 份，表明该套式PCR 具有良好的特异性、敏感性、重复性、准确性和临床适用性，可以用于临床病料中PCV3 的快速低含量检测。

4.1.3 荧光定量PCR 方法 荧光定量PCR 方法是在常规PCR 反应体系中加入荧光分子，利用荧光信号的累积实时监测整个PCR 反应进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析，整个PCR 反应和检测都在反应管中进行，样品污染的概率大幅降低，敏感性更高，特异性更强。李畅等[25]根据PCV3 ORF2基因组保守序列设计引物和TaqMan 探针，通过优化反应条件和反应体系，建立快速检测PCV3 的实时荧光定量PCR 检测方法，该方法的检测灵敏度为1.29×102拷贝/μL，比常规PCR 的灵敏度高100 倍，该方法检测PCV2、PRRSV、猪轮状病毒（RV）、猪链球菌、猪肺炎支原体等疫病均为阴性，批次内重复和批次间重复试验的变异系数均小于1.5%，应用该方法对2016—2017 年间收集的124 份来自湖北省等地的猪病料DNA 样品进行检测，PCV3 阳性率为8.06%，建立的TaqMan 荧光定量PCR 能够灵敏特异地检测PCV3，为PCV3 临床感染的早期诊断、流行病学调查、定量分析PCV3 感染程度以及发病机制研究提供了一种快速、简便、特异、敏感、准确的分子生物学检测技术。

4.1.4 LAMP 方法 环介导等温扩增技术（LAMP）是日本研究学者于2000 年发明的一种体外恒温核酸扩增技术，该方法不需要昂贵的仪器设备，在等温条件下就能快速完成反应，具有经济实用、高效、快速和简便等特点，已经用于多种猪病原检测。姜辰龙等[26]根据PCV3 ORF2 基因保守序列设计特异性引物，并通过对Bst DNA 聚合酶、引物最佳浓度比例、Mg2+、dNTPs 和甜菜碱浓度等反应条件的优化，建立了检测PCV3 的LAMP 检测方法，该方法59 ℃恒温扩增36 min 即可出现梯形条带，且产物亦可通过SYBR GreenⅠ染色进行判断，该方法最低检测限为1.0×101拷贝/μL，检测PCV1、PCV2、PRRSV、CSFV、PRV 均为阴性，应用该方法检测68 份呼吸道病猪淋巴结样品，PCV3 阳性率达30.9%，该方法与常规PCR 检测结果的符合率为95.6%。相对传统PCR 方法而言，LAMP 方法敏感特异，简便快速，可用于PCV3 的检测和临床诊断。

4.2 免疫学诊断方法

免疫学检测方法具有样品易于采集、检测快速、操作简单、高通量等优点，特别适合于大批量样品的检测和流行病学调查，特异、敏感的血清学检测方法并用于猪群中PCV3 感染的血清学检测对于PCV3 感染的早期诊断是十分必要的。目前，用于PCV3 的免疫学诊断方法主要有间接ELISA 方法和双抗体夹心ELISA 方法。

4.2.1 间接ELISA 方法 间接ELISA 方法是将诊断抗原直接固定在固相载体上，封闭后加入待检抗体，加入酶标记抗体和底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与待检抗体的量呈正相关，具有操作简单、快速，易于标准化，适合临床上检测大量样品等优点。王俊伟等[27]以PCV3 阳性病料为模板，PCR 扩增截短的ORF2 基因，并将其克隆至pET30a载体构建重组质粒，并转染至大肠杆菌BL21 感受态细胞，经IPTG 诱导获得了重组Cap 蛋白，以纯化后的重组Cap 蛋白作为包被抗原，建立PCV3 抗体的间接ELISA，该方法的批内和批间系数均小于10%，该方法检测PCV2、CSFV、PRRSV、PRV 阳性血清均为阴性，该方法检测采集的439 份临床猪血清，PCV3 抗体阳性检出率为60.59%，为当前PCV3 的诊断和流行病学调查提供一种快速、简便、敏感、特异的抗体检测方法。

4.2.2 双抗体夹心ELISA 方法 双抗体夹心ELISA的方法是将第一种抗体（捕获抗体）包被在固相载体上，封闭后加入待检抗原，温育后加入第二种抗体（检测抗体），捕获抗体和检测抗体可以是针对不同表位的两种单抗，也可以是针对同一抗原的一种单抗与一种多抗，加入酶标记抗体和底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与待检抗原的量直接相关，根据呈色的深浅进行定性或定量分析。于俊楠等[28]以抗PCV3 重组Cap 蛋白的单克隆抗体作为包被抗体，以抗Cap 蛋白的兔源多克隆抗体为检测抗体，优化反应条件，建立了检测PCV3 的双抗体夹心ELISA 方法，该方法检测PCV2、PRV、猪乙型脑炎病毒（JEV）均为阴性，该方法批内和批间的变异系数均小于5%，该方法检测采集的19 份临床病料样品，检测出11 份阳性样品，与常规PCR 方法的符合率达84.6%。夹心ELISA 检测方法具有良好的特异性、灵敏性和可重复性，可用于临床中PCV3 的检测，特别适合于PCV3 的大面积流行病学调查。

5 结语

鉴于PCV2 对我国养猪业的严重影响，对PCV3的流行以及造成的潜在危害必须有清醒的认识和足够的重视。病原学监测表明，我国猪群中已存在PCV3 的流行，且不同区域感染率差异较大，PCV3与其他病原的混合感染情况较严重，而且PCV3 与PCV2 之间不存在交叉免疫保护性，现有的商品化PCV2 疫苗无法为PCV3 的感染提供有效的免疫保护。对于PCV3 的各种实验室诊断技术，LAMP 方法对仪器设备要求较低，特别适合基层实验室快速检测，但敏感性太高，易导致假阳性。ELISA 方法操作简单、检测快速、高通量，特别适合用于大批量的流行病学调查。PCR 方法操作简单，是目前多数实验室进行PCV3 临床诊断和流行病学监测的主要方法，但PCR 方法不能定量且对扩增产物进行电泳时需使用溴化乙锭（EB），污染环境和威胁人体健康。荧光PCR 方法弥补了常规PCR 不能定量以及EB的污染问题，但对仪器和操作人员技术水平要求均较高，检测成本也较高，有条件的实验室可选择使用。相信随着分子生物学和免疫学诊断技术的不断改善与标准化，以及我国对PCV3 防控措施的不断完善，我国PCV3 的各种实验室诊断技术必将会走向不断成熟与完善，PCV3 的流行将会得到逐步控制，从而保障我国养猪业健康与稳定发展。