绿色荧光蛋白在植物与病原菌互作研究中的应用

史志丹，宋培玲，郝丽芬，皇甫海燕，燕孟娇，杨永青，郭 晨，贾晓清，皇甫九茹，李子钦，张宝辉，陈斐斐

（1.内蒙古大学 生命科学学院，内蒙古 呼和浩特 010021；2.内蒙古自治区农牧业科学院，内蒙古 呼和浩特 010031；3.呼伦贝尔农垦集团特泥河农牧场，内蒙古 特泥河 021024）

病原菌侵染寄主植物从可侵染部位的接触开始，到在寄主体内定殖、扩展、进而使寄主表现病症，在这个过程中植物个体也会产生相应的抗病或感病反应，并且在生理、组织和形态上产生一系列的变化。一种寄生物能否成为某种植物的病原菌，取决于病原菌能否克服寄主的抗病机制，如能克服，则病原菌有致病性，寄主植物表现感病，两者之间具有亲和互作关系。如不能克服，病原菌没有致病性，寄主植物表现抗病，两者之间具有非亲和性互作关系。寄主植物与病原菌之间具有非常复杂的相互作用，涉及植物与病原菌之间的识别、信号传导及植物防卫反应激活等事件[1]。因此，研究植物与病原菌的识别方式、亲和性或非亲和性的互作模式，对揭示植物与病原菌的互作机制具有重要意义[2]。借助分子标记方法，可以示踪病原菌在寄主中的入侵、定殖和繁殖过程。标记病原微生物的方法主要有抗生素抗性基因、lacZ 基因、lux 基因、inaZ 基因、xylE 基因、gus 基因以及gfp 基因[3]。目前，在病原菌与寄主互作的研究中，利用绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）标记病原菌，对其侵染过程进行示踪是最为有效的细胞学方法之一[4]。GFP 作为重要报告基因，具有高灵敏度、稳定性好、低细胞毒害性等特点。1962年，SHIMOMURA 等[5]首次在维多利亚多管发光水母中发现GFP，直到1992年PRASHER 等[6]克隆出GFP的cDNA 全长后，紧接着在1994年CHALFIE 等[7]在原核大肠杆菌和真核秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中成功表达了具有荧光性的GFP，同时也证明了GFP 在水母中特异组分不存在的条件下荧光也可以正常表达。同年，HEIM 等[8]提出GFP 生色团的发光机制，并表明了生色团的形成不需要任何酶或辅助因子的参与。此后，GFP 成为一个研究热点，在多个学科领域引起了广泛的关注，同时，GFP 作为一种新的报告分子或定位标记物在多种细菌、真菌、植物和哺乳动物细胞中得到广泛应用，且修饰后GFP 也作为生物探针被应用到试验中。

1 绿色荧光蛋白基因的病原菌转化方法

1973年，MISHRA和TATUM对粗糙链孢霉进行遗传转化，成功获得转化子后，关于丝状真菌遗传转化方法的研究迅速发展起来。用于遗传转化方法有很多，针对原生质体的遗传转化方法有CaCl2-PEG 介导转化法，制备真菌原生质体作为感受态细胞，在含有一定浓度的质粒CaCl2-PEG 缓冲液中，利用电荷间的相互作用力在原生质体表面与外源DNA 形成复合物，原生质体通过内吞作用将复合物整合在受体基因组中[9]。电击转化法是受体细胞在瞬间高电压处理下，形成可恢复的局部电穿孔，使质粒DNA 进入受体细胞，在一定时间内恢复正常生理状态从而获得遗传转化子[10]。限制性内切酶介导转化法（Restriction enzyme mediated integration，REMI）是将限制性内切酶与已经线性化的质粒在PEG的作用下导入受体细胞中，染色体DNA 被限制性内切酶切开与线性质粒连接，从而获得转化子[11]。针对完整细胞的遗传转化有基因枪转化法，该方法利用高速微弹发射装置，将外源DNA 包被在微小的金粒或钨粒表面射入受体细胞中，使外源DNA表达[12]。醋酸锂转化法，是利用高浓度Li+或其他一价金属阳离子（Na+、K+、Rb+等）诱导并增强细胞渗透性，使其成为感受态，在PEG 协助下完成外源DNA的转化[13]。农杆菌介导的遗传转化法（ATMT），主要是通过农杆菌Ti 质粒上的T-DNA 区和vir 区共同完成。T-DNA区是能够进行转移并整合进宿主基因的区域，vir 区参与T-DNA的加工、转移以及整合，小分子酚类和糖类物质诱导激发会促使vir 区基因表达，农杆菌侵染将T-DNA 转移并整合至真菌基因组中[14]，使目的基因表达。不同的转化方法在植物和病原菌中皆有应用。陈孝仁等[15]利用CaCl2-PEG 介导转化法用GFP首次标记了大豆疫霉，观察了大豆疫霉在大豆上的侵染动态并利用此报告系统显微观察了在抗病和感病大豆品种根部大豆疫霉游动孢子的侵染情况，从细胞水平上了解了大豆的抗疫病机制。宿景霞[16]采用电击转化方法，将含有绿色荧光蛋白基因的质粒转入溶磷细菌菌株中观察其在葡萄根际的存活特征和定殖动态规律。张鑫等[17]利用REMI 转化方法构建葡萄溃疡病菌（Lasiodiplodia theobromae）转化子库。基因枪法和醋酸锂法在真菌上的报道较少[18]。GU 等[19]利用基因枪法研究植物病原真菌分泌蛋白Ps87。醋酸锂转化法首次在酿酒酵母（Saccharomy cescerevisiae）的转化中获得成功，随后在鬼伞菌（Coprinus lagopus）和粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）等真菌的遗传转化中也获得成功[20]。赵凤轩[21]通过农杆菌介导法将构建的真菌表达载体pCH-sGFP 导入到大丽轮枝菌中，研究了转化子在不同抗病类型棉种中侵染过程的差异，此方法在真菌研究中得到了广泛的应用，根据转化对象的不同使用不同的转化方法，其转化效率也不相同。

2 绿色荧光蛋白在病原菌侵染过程中的应用

绿色荧光蛋白具有多种优点使其在研究病原菌侵染过程中广泛应用。GFP对受体细胞低毒害性，不会影响受体细胞的正常生长和功能，在紫外光或蓝光的照射激发下便可观察到绿色荧光，荧光稳定有较强的耐受性，可以方便、快捷地进行动态监测[22]。荧光蛋白标记病原菌后，筛选出荧光蛋白稳定表达和致病力无明显差异的转化子可以接种于不同生育期和不同组织的寄主植物，在不同时间点、不同的组织部位取样通过荧光或共聚焦显微镜直观地观察侵染部位的病原菌。自1996年SPELLIG 等成功转化了玉米黑粉菌，随后GFP 被应用在多个种属的真菌中。SEXTON 等[23]将gfp 基因导入黑胫病（Leptosphaeria maculans）中，观察其侵染油菜的过程。陶恺[24]通过绿色荧光蛋白标记菌株的获得，揭示了大豆疫霉与寄主亲和、非亲和互作的动态变化过程。贾娜娜[22]利用ATMT 技术对梨腐烂病菌进行绿色荧光蛋白标记，获得了梨腐烂病菌转化子，并用筛选到的强、弱致病力菌株转化子侵染梨树组织观察病原菌在梨树中的侵染过程。对获得的病原菌转化子利用分子技术扩增获得gfp 基因的两翼序列，分析突变的目的基因及其功能，从而为研究病原菌的致病机理提供基础[25]。张键[26]构建了大丽轮枝菌的T-DNA 突变体库，分析并研究了T-DNA 插入位点的侧翼序列以及突变基因的功能，发现敲除VdOCH1 基因能够降低病原菌的致病性。姚锦爱等[27]采用农杆菌介导法成功将绿色荧光蛋白转入到建兰茎腐病原尖孢镰刀菌F02 中，并获得了表达GFP的转化子。孙洪宝等[28]利用绿色荧光蛋白作为标记，明确了枯萎病菌在西瓜抗、感寄主根系中侵染和定殖动态，从组织学的角度阐释西瓜与枯萎病菌亲和互作和非亲和互作的差异。

3 绿色荧光蛋白在定量检测植物组织中病原物数量的应用

真菌与植物相互作用的研究中，通过研究受感染的宿主植物组织中病原菌生物量对于明确病害的进展具有重要意义。目前的研究方法存在一定的局限性。对真菌生物量的定量常通过几丁质和麦角甾醇的含量来检测。前者是细胞壁的组成成分，后者是真菌细胞膜的重要组成成分。但是，这两种物质存在于多种真菌中，因此这种测定方法不具有物种特异性。病原菌生物量的定量也可以通过测定特定蛋白质（DNA 或RNA）的量，但是，这两种方法比较耗时，且提取出的RNA 容易降解。而绿色荧光蛋白作为一种高效标记物有一个优点是其荧光强度和gfp的表达量成正比，MAOR 等[29]指出绿色荧光强度与异源金线菌转化株的菌丝数量高度相关，因此可以通过测定荧光强度而定量真菌的生物量。CHEN 等[30]利用改良的GFP标记大豆炭疽（Colletotrichum destructivum）和西瓜炭疽菌（Colletotrichum orbiculare），测定其接种叶片中绿色荧光蛋白的积累量，同时与Northern blot 杂交技术测定真菌肌动蛋白基因表达量做对比，结果表明，荧光量与真菌生长密切相关，利用GFP标记的真菌检测绿色荧光强度是一种准确、快速和简便的方法，可以定量寄主植物细胞内真菌的生长[31]。

4 绿色荧光蛋白在病原菌亚细胞结构定位中的应用

GFP作为一个分子标记可以在细胞的任何区域进行定位，因此，GFP 在真菌亚细胞的研究和蛋白功能研究中广泛运用。构建GFP 融合蛋白是亚细胞定位中的一种重要手段，亚细胞定位能明确表达蛋白产物在细胞中出现的部位，将GFP与细胞器相关蛋白融合表达，就可以观察候选蛋白在细胞核、细胞质或细胞膜的分布，以及在不同阶段的转运情况，这对于研究真菌的有丝分裂、蛋白分泌、菌丝融合等过程具有重要作用[32]。RIEDEL 等[33]通过GFP标记的橡树疫霉菌（Phytophthora ramorum），研究其各个生活史阶段营养体的细胞学形态，与未标记菌株相比，GFP菌株致病能力明显变化。AUDREY 等[34]通过将青色荧光蛋白（CFP）、绿色荧光蛋白（GFP）、黄色荧光蛋白（YFP）、红色荧光蛋白（mCherry）与已知亚细胞定位的基因的N 端或C 端相连，构建融合表达载体，对致病疫霉（Phytophthora infestans）体内的内质网、高尔基体、线粒体、细胞核以及过氧化物酶体等细胞器形态和分布进行了研究。郭晓宇等[35]利用荧光蛋白标记结合荧光染色的方法来研究稻瘟病菌有性世代的细胞结构，清晰地标记了子囊和子囊孢子的结构、细胞器和存储物质。

5 展望

绿色荧光蛋白广泛应用于植物病害的各个方面，从植物病原菌的检测、侵染定殖、抗病基因的表达、抗病转基因植株的筛选及病原菌致病机理的研究到分子生物学和生态学等方面的应用，GFP 都具有其他报告基因不可替代的优点。尤其是在研究病原菌与植物互作方面，能够实时明确病原菌的侵染过程。以上仅是GFP 众多应用中的一小部分，随着GFP 工程的发展，GFP的应用将会更加广阔。