跨界小RNA参与植物病原菌互作的研究进展

郝丽芬，燕孟娇，房永雨，宋培玲，皇甫海燕，郭 晨，杨永青，贾晓清，皇甫九茹，李子钦

（内蒙古自治区农牧业科学院，内蒙古 呼和浩特 010031）

植物在自然界生长，不可避免地要受到病原菌的侵染，促成了植物与病原菌的协同进化，人们已经认识到来自病原菌的效应子蛋白和来自植物的抗性蛋白（或次级代谢物）可以在植物和微生物之间转运，但是，近年研究证明，小RNA（sRNAs）也可以在不同生物界之间相互转运，并且跨界沉默对方的靶基因。这种沉默靶基因的机制被命名为跨界RNA 干扰[1]。

sRNAs以两种形式存在，微小RNA（microRNA，miRNA）和小干扰RNA（siRNA）。一般情况下，miRNA 起源于含有茎环结构的单链RNA；而siRNA起源于长的双链RNA的颠倒重复或依赖RNA的RNA 聚合酶（Rd RP）产物。siRNA 又可以根据其起源的路径不同分为反式作用siRNA（ta-siRNAs）、次级阶段siRNA（phasiRNAs）、异染色质siRNA（hcsiRNAs）、自然反转录siRNA（nat-siRNAs）和长链siRNAs（lsiRNAs）。ta-siRNAs 研究较深入，已经明确其在植物免疫和信号传导过程中具有重要功能[2]。研究也表明，22 nt miRNA和phasiRNAs可以靶向抑制NLR 基因和PRRs 基因，在平衡植物的抗性和生长中起调控作用[3-4]，hc-siRNAs 长度一般为24～30 nt，主要介导植物表观遗传[5]。lsiRNAs 长度一般为30～40 nt，研究发现其也参与植物抗性反应[6]。多项研究证明，miRNA和siRNA 在植物病原菌互作过程中发挥重要作用。2013年，sRNAs 首先在灰霉病菌与拟南芥、番茄的互作过程中被发现[7]，随后，科学家在多种植物和病原菌的互作过程中发现有sRNAs的参与，并将这种sRNAs 介导的寄主诱导基因沉默（HIGS）技术成功应用在植物保护工作中。笔者主要综述了sRNAs 合成路径和作用机理及其在寄主与病原菌互作过程中的转运机制和应用实例的研究进展，以期为跨界RNA 干扰技术在植物病害防控领域的广泛应用提供参考信息。

1 跨界sRNAs的合成路径

sRNAs 由于起源的路径不同，合成路径也不同。miRNAs 利用RNA 聚合酶Ⅱ（RNAPol Ⅱ）转录miRNA 基因产生原初miRNA，原初miRNA 转录形成折回结构，进一步加工形成带有茎环结构的前体miRNA（Pri-miRNA），由DICER 类蛋白1（DCL1）和HYL1（Hyponastic leaves 1）和SE（Serrate）作用形成双重sRNAs，被HEN1（Huenhancer 1）在3′端甲基化，进入细胞质，成熟的miRNA 会优先与AGO1 （Argonaute1） 蛋白结合，靶向切割目标mRNA[8]。

而siRNAs 来源于不完全配对的双链RNA（dsRNA）前体，其他来源于反义转录或RNA 依赖的RNA 聚合酶产物，RNAPol Ⅱ转录非编码TAS 基因，借助miRNAs和RNA 诱导的沉默复合物（RISCs）切割原始转录产物，产生5′片段和3′片段，在RDR6和SGS3 作用下，以产生的片段为模板合成互补链，形成双链RNA，再由DCL4和DRB4 作用形成ta-siRNAs。正义和反义转录cis-NATs 产生nat-siRNAs，参与的细胞组分有DCL1 或DCL2，HYL1和HEN1[9]。而hc-siRNAs和ta-siRNAs 一般来源于转座子、重复原件和异染色质区，合成依赖于DCL3-RDR2-Pol Ⅳ路径。而lsiRNAs的合成依赖于DCL1、HYL1、HEN1、AGO7、HST的共同作用，部分依赖于RDR6和Pol Ⅳ组分作用[8]。

成熟的miRNA和siRNAs与AGO蛋白结合形成RNA 诱导的沉默复合物（RISC）；活化的RISC以碱基互补配对的方式与靶mRNA 相结合，在酶的作用下将靶mRNA 切割降解或抑制其翻译，行使其抑制靶基因表达的功能；RNA 沉默中还存在级联放大效应，即以siRNA 中的一条链为引物，以mRNA为模板，在RNA 依赖的RNA 聚合酶（Rd RP）的作用下合成新的ds RNA，进而引发后续的循环扩大反应[10]。

2 跨界sRNAs的转运机制

植物分泌蛋白的方式分为传统分泌方式和非经典分泌方式。传统方式是蛋白质经过内质网-高尔基体途径将蛋白分泌到质膜和细胞外；非经典分泌方式（Unconventional protein secretion，UPS）[11]包括多种途径，其中参与植物免疫的途径有高尔基体旁路和特异细胞器介导的3种分泌方式，包括多泡体（MVB）、中心液泡（Central vacuole）和植物特异胞外阳性细胞器（Plant specific exocyst-positive organelles，EXPO）。植物胞外囊泡主要来源于MVB和EXPO与细胞膜的融合，参与植物的生物和非生物胁迫响应。胞外囊泡是小的膜封闭的囊泡隔室，胞外囊泡的主要功能是消除细胞内废物，被细胞释放到外界传送蛋白、RNA、代谢物和其他分子。基于物种起源路径和生物标记物，胞外囊泡分为3 类，分别是外来体、细胞微泡和凋亡体；外来体起源于管腔内的多泡体，细胞微泡是质膜向外形成的芽体，凋亡体的细胞凋亡过程产生的囊泡[12]。

近年来的研究发现，胞外囊泡是植物与病原菌交流的最主要途径[13]。20世纪60年代首次发现植物胞外囊泡[14]，2009年，首次从向日葵种子分离获得，这些胞外囊泡可以在离体条件下被核盘菌吸入，导致核盘菌形态改变、细胞死亡或生长停滞[15]，这表明胞外囊泡（Extracellular vesicles，EV）可以转运植物的抗性物质到病原菌。

胞外囊泡转运小RNA分子主要包括3种方式[16]。MVB 释放TET8/9 相关的外来体到细胞外空间，包含抗性相关的分子和寄主的小RNA。这些分子可以被病原菌内化抑制其毒性，例如，MVB 参与拟南芥对大麦白粉病菌（Blumeria graminis）的非宿主抗性反应。EXPO 是单层膜结合的胞外泡囊，可能与抗性分子的重新定位相关。另外，长10～17 nt 短非编码的sRNAs分子，可以通过PEN1 相关的囊泡传输，但不清楚是否和植物免疫有关。这3种胞外囊泡是独立存在的[17]。

研究发现，包含寄主sRNAs的植物外来体可以被真菌细胞在几小时内吸收，从含有胞外囊泡，并被葡萄孢霉菌感染的植物组织中分离葡萄孢霉（B.cinerea）原生质体，发现体内包含70%的植物sRNAs，这些研究证明胞外囊泡参与介导sRNAs的转运。敲除拟南芥TET8/9 会抑制寄主sRNAs的传输[18]，HOU 等[19]研究发现疫霉菌侵染拟南芥的过程中，大量siRNAs 存在于胞外囊泡中，不参与调控内源性植物基因，推测可能沉默疫霉菌的基因。因为在疫霉菌中引入植物siRNAs，导致疫霉菌发育缺陷和毒力丧失，而拟南芥的siRNAs 缺陷的突变体对疫霉菌是敏感的，说明胞外囊泡中的siRNAs可以转移到疫霉菌。

3 sRNAs 参与植物与病原菌互作的研究进展

3.1 寄主内源sRNAs 转运至病原菌

寄主植物与病原菌最初始的互作是激活植物先天免疫系统，由病原相关分子模式激发的免疫反应（PAMP-triggered immunity，PTI）和效应蛋白激发的免疫反应（Effector-triggered immunity，ETI）组成。PTI 反应是植物识别病原相关分子模式（PAMP），主要为病原菌细胞壁组分（几丁质、鞭毛蛋白等），产生非特异性的防卫反应。ETI 反应是病原菌分泌效应子进入寄主细胞，引起寄主产生抗性蛋白，产生特异性的防卫反应。而sRNAs 广泛存在于生物体中，在植物与病原菌的互作过程中发挥重要作用。NAVARRO ET 等[20]首次发现miRNA 参与植物免疫反应，表明拟南芥miR393 被PAMP 诱导产生，可以降低植物生长激素信号强度，引起PTI 反应。KATIYAR-AGARWAL 等[2]首次发现siRNA 参与植物免疫反应，证明细菌丁香假单孢菌（Pseudomonas syringae）诱导番茄产生nat-siRNAATGB2，携带效应子AvrRpt2，促进ETI 反应。ZHANG 等[21]鉴定得到两个靶向真菌致病基因的棉花miRNAs（miR166和miR159），两个致病基因分别编码Ca2+依赖的半胱氨酸蛋白酶（VdClp-1）和异木霉素C-15 羟化酶（VdHiC-15），输入两个miRNA 至棉花，诱导sRNAs跨界干扰两个致病基因的表达，增加了棉花对Verticillium的抗性。XU 等[22]研究发现，棉花黄萎病菌（Verticillium dahliae）的G 蛋白信号（RGS）调控因子受病原菌诱导上调表达，将其中的VdRGS1 基因敲除获得转基因菌株，发现病原菌在孢子产生、菌丝发育、微菌核形成方面受到严重影响，判断VdRGS1 基因对菌株的毒力形成起关键作用。在此基础上，利用病毒介导的HIGS 技术构建转基因棉花，发现该转基因棉花对Verticillium dahliae的抗性增强。针对VdRGS1 基因的HIGS 技术提供了有效防治棉花黄萎病的新思路。

3.2 病原菌内源sRNAs 转运至寄主植物

近年来，研究发现sRNAs 在调控病原菌毒性中发挥重要作用，可以作为一种新的效应子抑制寄主免疫，原核病原菌和真核病原菌都产生了大量的非编码sRNAs，当然，原核的sRNAs 显著不同于真核sRNAs。细菌的非编码sRNAs 是多样化的，长度在50 ～300 nt，大多数调控翻译效率和稳定靶向mRNAs，例如，黄单孢菌属（Xanthomonas）、农杆菌属（Agrobacterium）和果胶杆菌属（Pectobacterium）的非编码sRNAs 响应胁迫和调控病原菌毒力[23-25]。

关于真核病原菌致病相关的sRNAs 研究较多，在水稻稻瘟病研究中发现，大量sRNAs 在附着胞中富集[26]，还有灰霉病菌（B.cinerea）在感染初期产生大量的sRNAs，说明sRNAs 是参与植物防御反应的重要成员。真菌灰霉病菌（B.cinerea）、大丽轮枝菌（V.dahlia）和卵菌（Oomycete）产生sRNAs 效应子，可以移动到寄主细胞，并且利用寄主RNAi 机制结合到寄主AGO1 或者沉默多个寄主免疫基因，增强病原菌毒性[7，27]。小麦柄锈菌也使用这种策略传输milR1 到寄主细胞抑制病程相关蛋白基因2（PR2），抑制植物免疫[28]。WEIBERG 等[7]研究灰霉病菌（B.cinerea）感染拟南芥和番茄的早期阶段，发现Bc-sRNAs和信号调控相关基因被显著富集，其中跨界转运的3个Bc-sRNAs 靶向结合 拟南芥Argonaute 1（AGO1），沉默寄主抗性基因，影响拟南芥和番茄的免疫力，进一步进行试验，双突变B.cinerea的dcl1和dcl2 基因，不能合成DCL1和DCL2，造成sRNAs 合成受阻，影响了病原菌的毒性。证明病原菌产生sRNAs 转运至寄主，进而影响寄主免疫。

4 跨界sRNAs 在植物抗病育种中的应用

跨界sRNAs 发生在植物与多种病原微生物互作过程中，包括真菌、细菌、病毒和线虫等，针对病原真菌，利用HIGS 构建跨界RNAi 载体，沉默病原菌毒性相关的靶向基因[29]，从而使寄主获得对病原菌的抗性，跨界RNAi 作为植物抗病的新“武器”，拓展了对抗病/感病机制的认识，还为抗病生物技术的发展带来了新机遇，服务于我国农作物病害绿色防控[30]。例如，ZHANG 等[21，31]利用HIGS 技术培育出了可稳定遗传的转基因棉花，该棉花通过表达RNAi结构使大丽轮枝菌形成菌核的VdH1 基因沉默，病原菌丧失产生菌核的能力，毒力下降。田间试验证明，接种病原菌后，转基因棉花有效控制了棉花黄萎病，该研究首次通过田间试验证明HIGS 技术在植物抗病研究中的潜力。这些研究为利用sRNAs 技术进行农作物抗病虫改良提供了良好的范例。美国加利福尼亚大学的GOVINDARAJULU 等[32]利用HIGS技术培育出了抗莴苣盘梗霉（Bremia lactucae）的转基因莴苣，该作物通过表达RNAi 结构使莴苣盘梗霉中的关键基因发生沉默，这些基因的沉默抑制了病原菌的扩散，从而起到了控制霜霉病的作用，CHEN 等[33]利用HIGS 技术构建靶向镰刀菌FcGls1基因的RNAi 载体结构，导致菌丝细胞壁缺陷，转基因小麦对赤霉病表现出有效抗性。最新的研究发现，SKOMINSKA-DURDASIAK 等[34]基于文献研究和国际小麦基因组数据联盟的数据库比对结果，标记小麦参与跨界RNAi的14个基因，并通过重组自交系‘Apache×Biscay’证明（Rab5-like GTPase）基因、Ara6和Dicer1 基因与小麦赤霉病抗性有关。这为利用跨界RNAi 服务小麦育种提供了参考信息。ZHU 等[35]在小麦锈病（Puccinia striiformis）的研究中，发现PsFUZ7 是调控Puccinia striiformis 感染和发育的重要致病因子，针对PsFUZ7 基因，构建含有RNAi 结构的转基因小麦品系，其对Puccinia striiformis 具有很强的抗性。该研究证实了基于RNAi的生物技术可以有效保护农作物。

5 展望

近年来，我国提出农药减施增效，发展绿色农业的总体战略，跨界sRNAs的发现为发展环境友好型的植物保护举措提供了新的思路，是当前进行农作物抗病育种的新策略[30]。跨界sRNAs 进一步揭示了sRNAs 在植物免疫和病原菌毒力形成机制，明确了跨界sRNAs 是一把双刃剑，如何利用跨界sRNAs 抑制病原菌毒性基因的表达，如何利用跨界sRNAs 提高植物的免疫能力是当前急需解决的科学问题。随着深度测序技术的发展，建议利用新一代测序技术深入挖掘参与植物病原菌互作的sRNAs，充分了解sRNAs的调控作用。进一步鉴定来自病原菌的sRNAs和他们的目标基因，揭示病原菌的致病机制。还要进一步鉴定病原菌感染宿主过程中，sRNAs 合成路径的关键酶，揭示是否可以通过控制病原菌合成sRNAs 路径中的酶，进而控制病原菌的毒力。另外，在对sRNAs 功能鉴定的基础上，应该着重考虑如何将其应用于生产实际。争取将跨界RNAi 技术广泛应用于植物病害防控领域，为发展绿色农业提供有力工具。