黄原胶对体外模拟消化过程中4 种竹叶黄酮生物可及性的影响

李占明，蔡泓历，梁 奕，毛 豪，廖晗雪，俞 玥*，周冬仁

（1.中国计量大学生命科学学院，浙江 杭州 310018；2.浙江省农业科学院食品科学研究所，浙江 杭州 310021；3.浙江省淡水水产研究所，浙江省渔业健康与营养重点实验室，浙江 湖州 313001）

现有研究表明，植物来源的天然抗氧化物质能够有效干预氧化应激，对相关疾病的预防具有重要意义，是当前天然活性物质开发研究领域的热点问题[1-3]。植物黄酮类膳食补充剂的摄入对于维持和促进人体生理健康具有积极意义[4-5]。研究证实，谷物黄酮可以明显抑制由脂质体引起的细胞炎症，发挥抗炎作用[6]。同时，植物黄酮还可以通过介导细胞凋亡来实现其对氧化损伤的保护作用[7]。生物可及性是指生物活性物质在摄入之后能被机体吸收的比例，然而，植物黄酮在胃肠道消化中易被降解，导致生物可及性降低，这限制了其生物活性的发挥[8-9]。生物可及性的提高使活性物质得以进入循环系统，发挥其生物活性[10]。因此，提高植物来源的黄酮类抗氧化物质的生物可及性对其产品开发及生物活性的利用至关重要。

植物来源的竹叶碳苷黄酮是黄酮类抗氧化剂，因其具有抗炎、抗辐射、抗肿瘤等良好的生物活性，近年来引起广泛关注[11]。据报道，来源于金刚竹的竹叶抗氧化提取物中主要的标志性碳苷黄酮为荭草苷、异荭草苷、牡荆素、异牡荆素[12-13]。近来，针对竹叶碳苷黄酮的研究大多集中在其粗提物的抗氧化活性等方面[14-15]，鲜有研究关注其经胃肠道消化后的生物可及性。含碳苷黄酮的食物进入口腔，经胃肠消化后，剩余部分得以达到小肠壁，然后经被动运输进入循环系统[16-17]，在消化过程中，不同消化阶段消化液pH值的变化加剧了黄酮的降解[18-19]。目前关于提升膳食黄酮类物质生物可及性的研究有待深入开展。

体外模拟消化模型的应用有助于减少实验动物的使用，便于在体外进行相关的物理、化学特性研究。相较于体内消化研究，体外模拟消化模型具有操作便利、避免伦理学冲突、低成本、快速等特点，因此，近年来得到了大量的关注[20-21]。同时，研究表明，纤维素可以用来提升植物活性物质生物可及性。纤维素与生物活性物质经过物理包覆后，其在消化过程中的降解大大减少，此外，膳食纤维的加入有助于降低胃肠道消化液的通过速度，减少生物活性物质的损失[22-23]。本课题组在前期研究中发现，相较于添加羧甲基纤维素钠、支链淀粉、阿拉伯胶等物质，在模拟肠道消化时，添加黄原胶有助于提升竹叶黄酮的生物可及性。鉴于此，本实验构建体外模拟消化模型，系统探究黄原胶对4 种竹叶碳苷黄酮生物可及性的提升作用。同时，采用主成分分析和聚类分析研究不同的消化液消化阶段添加黄原胶后，4 种碳苷黄酮生物可及性的聚类趋势及不同碳苷黄酮质量浓度变化的线性关系。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

竹叶 浙江圣氏生物科技有限公司；4 种竹叶黄酮（异荭草苷、荭草苷、异牡荆素、牡荆素）标准品为实验室自制（纯度均大于98%）。

黄原胶、α-淀粉酶、胆酸钠 上海阿拉丁试剂有限公司；福林-酚试剂、胃蛋白酶、胰蛋白酶 美国Sigma-Aldrich公司。

1.2 仪器与设备

Synergy H2多功能酶标仪、离心机 美国Biotek公司；Acquity超高效液相色谱（ultra-high performance liquid chromatography，UPLC）系统 美国Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 竹叶碳苷黄酮提取物的制备

干燥竹叶（PhyllostachysSiet. et Zucc leaf）经粉碎机粉碎后，用体积分数80%的乙醇溶液在持续搅拌下提取3 h[24]，提取物浓缩后进行喷雾干燥，得到竹叶提取物粉末，干燥粉末经水溶解，8 000×g离心10 min后的溶液用于总酚、总黄酮含量的测定及体外模拟消化实验。

1.3.2 总酚含量的测定

总酚含量的测定依据福林-酚法[25-26]。配制0.1 mg/mL没食子酸工作溶液。将不同体积（0、20、40、60、80、100、120 µL）的没食子酸工作溶液加入离心管中，然后加入40 µL福林-酚试剂，再加入质量分数为12%的碳酸钠溶液80 µL，用去离子水将反应液总体积补足至1 mL，暗处反应2 h后，将反应液加入酶标板，每个质量浓度4 个重复，在765 nm波长处测定溶液的吸光度，制作标准曲线，依据标准曲线计算总酚的含量，结果以每克干物质中没食子酸当量表示。

1.3.3 总黄酮含量的测定

总黄酮含量的测定依据文献[27-28]的方法，以儿茶素为标准品，依据标准曲线进行计算，结果以每克干物质中儿茶素当量表示。

1.3.4 体外消化模型的建立

本研究的消化对象为未经消化的20 mg/L竹叶碳苷黄酮提取物（原始样品）、竹叶碳苷黄酮提取物与黄原胶混合液（两者质量浓度分别为20、16 mg/L）（黄原胶保护组）和20 mg/L竹叶碳苷黄酮提取物（直接消化组）。原始样品不做消化处理，作为对照品；将黄原胶保护组、直接消化组经模拟消化后各阶段的样品与原始样品的竹叶碳苷黄酮质量浓度作对比。

口腔、胃、肠道体外消化模型的建立参考文献[29]。取9 mL样品溶液，加入1 mLα-淀粉酶，37 ℃孵育10 min后，用1 mol/L的盐酸溶液调节pH值到2.0，得到模拟口腔消化后的样品A10（取样4 个，每个样品体积500 µL）；在取样后剩余的A10样品中加入1 mL胃蛋白酶（10 mg/mL），于37 ℃孵育90 min，然后用碳酸钠调节pH值至7.0，得到模拟胃消化后的样品B90（取4 个样品，每个体积500 µL）；在取样后剩余的B90样品中加入2.5 mL胰蛋白酶（10 mg/mL）和2.5 mL胆酸钠溶液（50 mg/mL），37 ℃孵育90 min，孵育结束后，再经90～95 ℃水浴10 min，得到模拟肠道消化后的样品C90（取4 个样品，每个体积500 µL）。黄原胶保护组、直接消化组各阶段得到的样品分别标记为xA10、xB90、xC90和dA10、dB90、dC90，原始样品记作O。消化后的样品冷冻干燥后用UPLC法检测叶炭苷黄酮质量浓度。

1.3.5 4 种竹叶炭苷黄酮质量浓度测定

采用UPLC法测定4 种竹叶炭苷黄酮（异荭草苷、荭草苷、异牡荆素、牡荆素）的质量浓度。未经处理的样品定容后直接测定。直接消化组和黄原胶保护组样品经冷冻干燥后，加入1 mL甲醇，漩涡混匀后8 000×g离心10 min，上清液用滤膜过滤后进行UPLC测定。

测试条件：ACQUITY UPLC BEH C8色谱柱（150 mm×2.1 mm，1.7 µm），测定波长为340 nm，进样量为1 µL，流动相A（100%乙腈）、流动相B（体积分数0.1%磷酸溶液）的体积比为80∶20，流速为0.21 mL/min。

1.3.6 生物可及性测定

生物可及性是指物质从基质释放到消化道中，有可能被吸附进入循环系统（血管）的比例[30]。生物可及性采用下式计算。

1.4 数据统计与分析

数据处理应用SPSS 19.0软件，采用One-way ANOVA程序进行单因素方差分析，P＜0.05表示差异显著。采用主成分分析和聚类分析研究不同处理样品的4 种碳苷黄酮质量浓度的聚类趋势，用皮尔逊线性分析法分析4 种碳苷黄酮质量浓度变化之间的线性关系。采用Origin 9软件作图。

2 结果与分析

2.1 竹叶碳苷黄酮总酚、总黄酮含量及UPLC分析结果

图 1 竹叶提取物中4 种碳苷黄酮（A）、标准品（B）的UPLC图谱及分子结构（C）Fig. 1 UPLC of four flavonoid C-glycosides in bamboo leaf extract (A)and standard solutions (B), as well as their structures (C)

提取物中总酚含量为（78.83±1.29）mg/g，总黄酮含量为（79.93±2.08）mg/g。如图1所示，原始样品中异荭草苷、荭草苷、异牡荆素、牡荆素的质量浓度分别为239.25、67.05、58.12、27.04 mg/L。体外消化后的样品在不同消化阶段取样后冷冻干燥，取干燥后的样品进行UPLC分析。

2.2 体外模拟消化中各阶段不同样品组的竹叶黄酮质量浓度

由图2可知，原始样品组的4 种碳苷黄酮的质量浓度均最高。而直接消化组样品结果显示，口腔、胃、肠道的模拟消化均会造成4 种碳苷黄酮质量浓度不同程度地下降，各个消化阶段造成的黄酮质量浓度下降的趋势存在差异。与原始样品相比，模拟口腔消化阶段，直接消化组、黄原胶保护组样品异荭草苷质量浓度分别下降约30%、20%；模拟胃消化阶段，直接消化组样品异荭草苷质量浓度下降50%左右，而黄原胶保护组的异荭草苷质量浓度约下降35%；模拟肠道消化阶段，直接消化组样品异荭草苷质量浓度下降88%左右，而黄原胶保护组的异荭草苷质量浓度约下降85%。以上结果表明，直接消化组和黄原胶保护组样品在3 个消化阶段的异荭草苷质量浓度均存在显著性差异（P＜0.05）。综合比较3 种体外模拟消化阶段发现，肠道模拟消化对异荭草苷造成的损失最大。对于异牡荆素和牡荆素，模拟肠道消化后，黄原胶保护组的质量浓度分别降低了62%和59%，远低于直接消化组（分别降低84%和80%）。所有样品中4 种黄酮的质量浓度均为：异荭草苷＞荭草苷＞异牡荆素＞牡荆素。

图 2 不同模拟消化阶段各样品中4 种碳苷黄酮的质量浓度Fig. 2 Concentrations of four flavonoid C-glycosides at different digestion stages

与直接消化组相比，黄原胶保护组4 种碳苷黄酮质量浓度的下降均显著减缓（P＜0.05），表明黄原胶的加入有效地降低了4 种碳苷黄酮在体外模拟消化过程中的损失。另外，对黄原胶保护组不同模拟消化阶段的碳苷黄酮质量浓度进行比较，发现肠道模拟消化造成的碳苷黄酮的损失明显高于口腔模拟消化和胃模拟消化。胃模拟消化后4 种碳苷黄酮质量浓度相较于口腔模拟消化后仅轻微下降。本课题组在先前针对果胶的研究中同样证实，口腔模拟消化中碳苷黄酮质量浓度的损失明显小于胃肠道模拟消化[22]。肠道模拟消化后竹叶碳苷黄酮的损失明显高于胃模拟消化，可能的原因是，在消化过程中消化液pH值的变化加剧了碳苷黄酮的分解[31]。在肠道模拟消化阶段，黄原胶保护组4 种竹叶碳苷黄酮的质量浓度显著高于直接消化组（P＜0.05），表明黄原胶对4 种碳苷黄酮存在保护作用。本研究结果与先前关于纤维素可以提升植物活性物质生物可及性的研究结果[23,32]一致。

2.3 体外模拟肠消化后碳苷黄酮质量浓度变化的线性关系

表 1 模拟肠消化后4 种碳苷黄酮质量浓度的皮尔逊分析结果Table 1 Pearson analysis of linear correlations among four flavonoid C-glycosides after intestinal digestion

对模拟肠消化后的4 种碳苷黄酮的质量浓度进行皮尔逊相关性分析，结果如表1所示。相关系数r值大于0.9，表明有良好的线性关系，P＜0.05表明线性关系显著，P＜0.01表明线性相关性极显著。由于P＜0.01，因此4 种碳苷黄酮的质量浓度存在极显著线性相关性。对4 种碳苷黄酮的质量浓度进行线性拟合，如图3所示，4 个重复的7 种样品（原始样品＋3 个阶段（口腔、胃、肠道消化）直接消化组样品＋3 个阶段（口腔、胃、肠道消化）黄原胶保护组样品）线性拟合结果显示，不同样品的4 种黄酮质量浓度之间均存在良好的线性关系。

图 3 不同处理组4 种碳苷黄酮质量浓度之间的线性关系Fig. 3 Linear correlations among concentrations of flavonoid C-glycosides

2.4 不同模拟消化阶段4 种碳苷黄酮生物可及性的变化

表 2 不同处理样品中4 种竹叶碳苷黄酮的生物可及性Table 2 Bioaccessibility of four flavonoid C-glycosides in different samples

为了进一步揭示黄原胶对碳苷黄酮的保护作用，对不同体外模拟消化阶段4 种碳苷黄酮的生物可及性进行了比较（表2）。比较直接消化组样品的异牡荆素和牡荆素的生物可及性，发现经模拟肠道消化后，加入黄原胶后异牡荆素的生物可及性提升了140%，牡荆素的生物可及性提升了105%。比较3 个体外模拟消化阶段发现，黄原胶保护组4 种竹叶碳苷黄酮的生物可及性均高于直接消化组样品，表明黄原胶处理对胃模拟消化和肠道模拟消化时黄酮的降解存在保护作用。综上，黄原胶的加入提升了体外模拟消化过程中4 种碳苷黄酮的生物可及性。

同时，比较发现，黄原胶对异牡荆素和牡荆素的保护作用明显强于对异荭草苷和荭草苷的保护作用，可能是其结构不同导致的[33]：异荭草苷和荭草苷是同分异构体，其结构相近，在同样的体外模拟消化处理环境中降解程度接近；牡荆素和异牡荆素是同分异构体，体外模拟消化对其生物可及性的影响接近。尽管黄原胶保护组牡荆素和异牡荆素在肠道模拟消化后生物可及性高于直接消化组80%以上，但总体的生物可及性仍需提高，以使其更好地发挥竹叶碳苷黄酮的生物功效。

2.5 竹叶碳苷黄酮质量浓度变化的主成分分析与聚类分析结果

图 4 不同处理组碳苷黄酮聚类分析的三维得分图Fig. 4 Cluster plot of top three principal components for flavonoid C-glycosides in different groups

为进一步探究黄原胶的加入对4 种竹叶碳苷黄酮质量浓度的影响，对原始样品、直接消化组样品、黄原胶保护组样品中4 种碳苷黄酮的质量浓度进行主成分分析。如图4所示，前3 个主成分（PC1、PC2、PC3）可以代表99.89%的信息。不同处理组样品呈现不同的聚类趋势，原始样品聚为一组，直接消化组样品聚为一组，黄原胶保护组样品聚为一组，表明主成分可以很好地反映样品信息，各组样品组内的黄酮质量浓度变化差异小。对样品进行聚类分析（图5），结果显示，样品xC90与样品dC90在欧氏距离平方1.2左右聚为一类，样品xB90、dB90、xA10与dA10在欧氏距离平方1.3聚为一类，与主成分分析结果一致，表明模拟消化阶段影响4 种竹叶碳苷黄酮质量浓度的聚类趋势。聚类趋势分析表明，模拟口腔及胃消化与模拟肠道消化时，不同处理组样品的4 种竹叶碳苷黄酮质量浓度存在差异。

图 5 不同处理组的聚类分析图Fig. 5 Cluster analysis of different groups of samples

2.6 黄酮生物可及性变化机制的分析结果

研究证实，淀粉及纤维素等可以在胃肠道消化过程中以成胶或者包覆的形式对植物活性小分子物质提供保护[23,34]。纤维素或者淀粉的分子空腔可以容纳小分子的生物活性物质，使其抵御消化液消化[35-36]。纤维素分子的物理包覆或者封装减少了黄酮分子的降解，使其更容易通过消化道壁继而进入循环系统发挥其生物活性[22]。植物黄酮与其他的食品成分混合可以有效地缓解由消化液pH值变化产生的降解，提升其生物可及性。Chen Hua等[37]也证实了玉米淀粉的支链空隙可以容纳槲皮素分子，并有望作为小分子活性物质的理想载体。图6为黄原胶分子对竹叶碳苷黄酮分子的保护作用示意图，黄原胶分子内的氢键以及黄原胶分子的交联结构形成的空腔可以容纳黄酮分子，在消化过程中增加其抵御消化液消化的能力，提升其生物可及性[18-19]。

图 6 黄原胶提升竹叶提取物中竹叶碳苷黄酮在模拟消化过程中的生物可及性示意图Fig. 6 Schematic of branch space of xanthan gum for the improvement of bamboo leaf flavonoids bioaccessibility during simulated in vitro gastrointestinal digestion

3 结 论

本研究利用体外模拟消化模型，结合UPLC技术分析竹叶提取物中4 种碳苷黄酮（异荭草苷、荭草苷、异牡荆素和牡荆素）的质量浓度变化，探究黄原胶对竹叶碳苷黄酮在消化过程中的保护作用。结果显示，相较于直接消化组样品，黄原胶的加入可以显著减少在模拟消化过程中竹叶碳苷黄酮的降解，利于提升其生物可及性。口腔、胃、肠道模拟消化对竹叶碳苷黄酮的生物可及性影响存在差异，其中肠道模拟消化对直接消化组和黄原胶保护组样品的竹叶碳苷黄酮质量浓度影响高于口腔和胃模拟消化处理。黄原胶的加入可以提升牡荆素和异牡荆素的生物可及性。综上，黄原胶有助于提升体外模拟消化过程中竹叶碳苷黄酮的生物可及性，对于相关功能产品的开发具有较好的应用价值。